荧光假单胞菌的培养特征与分离筛选及作用机制！
小杨 / 2022-06-21 09:15:21
一、背景
荧光假单胞菌属薄壁菌门假单胞菌科假单胞菌属，属于rRNAI群荧光假单胞菌DNA同源组。荧光假单胞菌DNA同源群包括荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌，是一种革兰阳性杆菌，以不产绿脓素而产荧光素而得名。为环境污染菌。对人类是少见机会病原菌，可从伤口、痰、胸水、尿和血液中分离出，亦可从血库血中分离。可在冰箱储存的血液及血液制品中繁殖，而且自溶后释放内毒素。
其内毒素的磷脂体部分，可导致不可逆的休克。依据菌落形态、色素、生理生化和营养的特性等表型特征将荧光假单胞菌分为5个生物型：I、II、III、IV、G。最早对荧光假单胞菌生防作用的研究是在1978年发现处理马铃薯种块能增加产量。19世纪70年代首次提出荧光假单胞菌产生的噬铁素促进植物生长并抑制植物病害，1986年首次报道克隆得到菌株的抗生素基因。
荧光假单胞菌能够产生10多种抗生性次级代谢产物，在生物防治和生防菌剂的开发及应用方面有巨大的潜力。近年来，随着分子生物学的广泛渗入，通过对这些作用机制的遗传性状进行分析，采用遗传工程加以改良，使得荧光假单胞菌具有更诱人的生防效果。但是，随着对荧光假单胞菌的深入研究，一些学者发现荧光假单胞菌也存在一定的危害培养特征。
二、培养特征
荧光假单胞菌是典型的革兰氏阴性菌，电镜观察其菌体呈杆状，对数生长期时大小一般为（0.7～0.8）μm×（2.3～2.8）μm，呈单个或成对排列，具有极生鞭毛，偶见无鞭毛无动力的菌株，运动活泼，不形成芽孢。DNA的G+C比例范围为59.4～61.3克分子％，生物型IV有最低值，生物型II有最高值。该菌能液化明胶，葡萄糖发酵、蔗糖发酵、乳糖发酵均为阳性，并且能以多种醇类物质作为碳源，不能利用乙醇、L－鼠李糖等。甲基红试验、柠檬酸盐发酵、接触酶反应均为阳性，水解淀粉、脂酶反应阴性，对青霉素有抗性，不产生绿脓菌素。
具有分解纤维素、蛋白质和结合Fe3+ 的能力，但不能分解几丁质。有些菌株（生物型II，III和IV）能进行反硝化，生物型I和III在卵黄反应中为阳性，生物型I一般可分解脂肪，生物型II不解脂。营专性好氧生活，可在pH5.7和7％ NaCl的环境中生长，最适生长温度约25～30℃。大多数菌株在4℃或4℃以下生长，在41℃不生长。
荧光假单胞菌在KMB固体培养基上于28℃下培养2d后，生长良好，菌落微隆起，砖红色，边缘呈波浪花纹向外扩展，表面较湿润稍凸起不透明，易用接种针挑起，与该菌属下其他种类的典型区别在于能产生水溶性的黄绿色素（青脓素），紫外线（366nm）斜光照射下可见黄绿色荧光。荧光假单胞菌在普通培养基、麦康凯、沙门和志贺菌属琼脂培养基平板上均可生长。在PDA培养基上长势极弱或不生长，菌落深红色。
微生物的良好生长需要培养基各组分浓度和比例合适，碳源和氮源对菌体的生长或蛋白的表达影响较大，浓度太低会造成营养缺乏，限制菌体正常生长，进而影响代谢产物的产量。国内外一些学者对荧光假单胞菌的最佳生长条件做了研究，对一些促生菌和生防菌的最适培养条件进行了测定和分析，为菌株的最佳发酵条件和生态适应性评价提供了依据。
三、作用机制及应用
荧光假单胞菌是一种重要的植物病害生防菌和根际促生菌（PGPR），具有繁殖速度快、适应能力强、易于人工培养、制剂稳定、施用方便、不污染环境、防治多种植物病害等优点。研究表明，荧光假单胞菌抑制病原菌的菌丝生长、游动孢子囊的产生和游动孢子的萌发，在显微镜下观察发现生防菌使病原菌菌丝发生畸形。
生防菌的抑菌圈直径大，抑菌率高。通过降低病害的发病程度，能够提高植物种子的发芽率和活力指数，从而保证农作物的正常生长。生防菌能在根部定殖，也能通过叶面喷施来防治病害。有学者不仅在室内进行了拮抗性研究，还在田间测试了荧光假单胞菌的防治效果，结果发现拮抗效果都非常明显。该菌的生防机制包括：抗生素作用、噬铁素对铁的营养竞争、有效的根际定殖、次生抗性代谢物和诱导植物系统抗性等。
1、抗生素介导的抑制
荧光假单胞菌可通过产生多种抗生素对植物病害的病原物产生抑制。产生抗生素是生防菌抵抗病原菌的重要机制。细菌通过系统抗性的诱导或者通过抗微生物化合物的合成保护植物。荧光假单胞菌产生的抗生素有1－羧基吩嗪（PCA）、2，4－二乙酰藤黄酚（DAPG）、藤黄绿脓菌素（Plt）、吡咯菌素（Prn）、绿脓菌素（PyOCyAnin）、卵菌素A（OOmyCinA）等。
PCA为吩嗪类物质，在细胞内作为电子载体传递电子到靶细胞，增加胞内超氧化物自由基，使靶细胞中毒死亡；DAPG和Plt为聚酮类抗生素，具有广谱抗菌活性；Prn属于氨基糖甘类抗生素，在低浓度时破坏氧化磷酸化的偶联机制，而在高浓度时阻止参与呼吸作用的黄素蛋白和细胞色素C的电子运输。许多学者认为荧光假单胞菌产生的DAPG是拮抗根部病害的关键因素，DAPG充当诱导其本身的生物合成基因的表达信号的化合物。这些抗生素通常在很低浓度下就可阻碍病原微生物的生长。
2、噬铁素介导的抑制
荧光噬铁素是由荧光假单胞菌产生的胞外水溶性黄绿色素，是其特有的铁载体，可以螯合环境中微量的铁元素。其作用机制是通过配合基的螯合反应，形成铁－噬铁素螯合物，从而增加土壤中的生物有效性，并通过特异的转动系统将铁转移到体内，不仅可以满足自身的生长需要，还可以使环境中的铁浓度进一步降低，抑制病原微生物的生长繁殖，进而达到控制植物病害的目的。
3、根部定殖
荧光假单胞菌只有成功地在根际定殖后，其抑制机制才能真正起作用。荧光假单胞菌能在幼根表面形成一层均匀的保护层；而没有防病作用的菌株不产生保护层，说明荧光假单胞菌在根部定殖时保护了病原菌的侵染位点，降低侵染机会，是防病的关键因素之一。不同的荧光假单胞菌在不同的根际有不同的定殖能力。定殖能力的强弱也与土壤类型相关的间接因素如湿度、温度、PＨ 值等有关。
4、次生抗性代谢物
荧光假单胞菌产生许多具有抗性的次生代谢物，对植物病原菌具有拮抗作用。如一些荧光假单胞菌产生的HCN能影响植物的病原菌。荧光假单胞菌还能产生几丁质酶、溶菌酶、木聚糖酶和胞外壳聚糖酶等对物质进行降解，在给植物提供营养的同时还可减少植物病害的发生。
5、诱导植物系统抗性
某些植物如烟草、黄瓜、拟南芥等对病毒、细菌和真菌叶部病原的诱导抗性可能是由于一些荧光假单胞菌在根部的定殖而产生。其可能的作用机制是产生抗微生物的低分子量化学物质，如植物保护素、双萜、多聚物、木质素和糖蛋白，诱导一些水解酶和氧化酶类。水杨酸、脂多糖、噬铁素是重要的诱导物质。植物种类、植物病害以及植物生长环境的不同，荧光假单胞菌抑制病原菌的机理有所不同。
研究表明，荧光假单胞菌产生的抗生素可以改变病原菌细胞的通透性，降低细胞的表面张力，从而使细胞破裂死亡。研究表明，荧光假单胞菌产生的噬铁素螯合了铁元素，降低了环境中的铁元素的浓度，从而让病原菌不能很好地生长，达到抑制病害的目的。
目前，国内外学者通过基因手段检测次生代谢产物对植物病害防治的研究较多。许多学者通过基因手段，将合成次生代谢产物的基因突变，发现不产生次生代谢产物的缺失突变株无防病功能或防病能力明显下降，纯化后的次生代谢产物通过诱导局部和系统抗病性而发挥防病作用。研究了如何利用GACA/GACS系统检测遗传稳定性好的优良菌株VUPf5产生次生代谢产物防止小麦上的病害。通过对VUPf5的GACA基因和GACS基因进行突变，然后与具野生型基因的菌株对比，发现生产次生代谢产物的效率显著降低。
四、风险
荧光假单胞菌除了可以防治植物的病害之外，本身还是一种环境污染菌。在日常生活中，荧光假单胞菌是奶类、蛋类在低温保存条件下导致腐败变质的主要细菌之一。荧光假单胞菌对于人类是一种罕见的机会致病菌。在临床上最多见的是血液及血制品被荧光假单胞菌污染，当病人输入了被荧光假单胞菌污染的血液及血制品后，可出现败血症、感染性休克和血管内凝血等严重后果。
由于现有的许多抗生素对荧光假单胞菌都不敏感，所以一旦感染此菌，病死率很高。荧光假单胞菌还可以使一些动物体发生病变，产生相应的症状。在植物体中，荧光假单胞菌可以协同一些病虫害加重对植物体的危害，如研究发现，松材线虫在结合有毒的荧光假单胞菌时，能够促进黑松的致病率。荧光假单胞菌对动植物的危害受到外部环境的影响，越有利于荧光假单胞菌生长的环境就对动植物的危害越大。
随着接种冰核细菌的浓度增加，烟株的冻害程度逐渐加剧。假单胞菌属中除了荧光假单胞菌之外，其他的假单胞菌也能造成环境的污染。研究发现宁波沿海陆源排污口中存在较多的假单胞菌属，假单胞菌属的含量与排污口的主要污染物有关，氨氮含量较高的排污口假单胞菌属的含量更高。还推测与季节性温度变化有关。
五、分离筛选
目前，通常采用平板稀释法分离筛选荧光假单胞菌。分离筛选的指标包括荧光假单胞菌的体外病原体抑制、生物表面活性剂的生产、磷酸盐的溶解能力和参与抗生素合成的基因等方面，从而得到生防能力较强的菌株。对分离筛选得到的菌株经过形态、生理生化试验以及16ＳrRNA基因序列分析，参考《伯杰细菌鉴定手册》就可鉴定此类生防菌为荧光假单胞菌。近些年，研究者从不同植物根际对荧光假单胞菌进行了分离筛选，获得了一些有应用潜力的菌株：
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