一、背景
小鼠前列腺癌细胞分离自小鼠源前列腺癌的上皮细胞样贴壁细胞，主要用于RM-1(RM1)小鼠前列腺癌细胞的体外研究。RM-1(RM1)小鼠前列腺癌细胞支原体、细菌、酵母和真菌检测为阴性。培养条件：DMEM+10%FBS，37℃，5%CO2，冻存条件：90%FBS+10%DMSO。
二、细胞培养步骤
1、培养基及培养冻存条件准备：
1）准备DMEM(1.5g/L NaHCO3)90%；优质胎牛血清，10%1%p/s。
2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。
3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。
2、细胞处理：
1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，离心管加入4mL培养基混合均匀。在800-1000RPM条件下离心4-5分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入T25培养瓶中培养，补加培养基至6ml。
2）细胞传代：如果细胞密度达80%，即可进行传代培养。
注：第一次传代推荐传代比例为1:2，以后传代比例可根据客户需要自己决定。
3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。
下面T25瓶为类；
1，细胞冻存时，取上清，可使用血球计数板计数。
2，4min，1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度1-2xE6/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。
3，将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，至少2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
三、应用
用于Nrf2抑制前列腺癌细胞增殖的机制研究：
细胞氧化还原反应中的关键因子Nrf2在癌症的预防和治疗中的作用是研究的热点,但因Nrf2特殊的双重作用,其在前列腺癌进展中发挥作用的机制目前尚不清楚。定位于高尔基体的Golgi phosphoprotein-3（GOLPH3）与前列腺癌的演进高度相关,促进前列腺癌由激素依赖性向去势抵抗性转化,其表达水平的增高意味着前列腺癌侵袭性的增强。本文拟从氧化还原反应及GOLPH3的角度,探讨Nrf2的表达对前列腺癌细胞增殖的影响及其产生作用的机制。
方法：
1) 培养激素依赖性人前列腺癌细胞LNCa P,及去势抵抗性人前列腺癌细胞DU-145,显微镜观察其生长状况;
2) 蛋白印迹（Western Blot）检测Nrf2蛋白在LNCa P及DU145中的表达;
3) 流式细胞仪检测LNCa P及DU145细胞内活性氧含量;
4) 重组质粒p EGFP-Nrf2、空载质粒p EGFP-N1分别瞬时转染LNCa P和DU145细胞,分别形成LNCa P-Nrf2-OE、LNCa P-Con及DU145-Nrf2-OE和DU145-Con细胞；
5) 分别将重载质粒、空载质粒的LNCa P和DU145细胞制成细胞蜡块,免疫组化法检测两组细胞中的GOLPH3蛋白表达情况;
6) 蛋白印迹（Western Blot）检测重载质粒、空载质粒的LNCa P和DU145细胞中GOLPH3蛋白的表达情况;
7) 实时荧光定量（RT-PCR）检测Nrf2过表达对GOLPH3 m RNA在重载质粒、空载质粒的LNCa P和DU145细胞中的表达的影响;
8）建立Keap1过表达的LNCa P-Nrf2-OE-Keap1与DU145-Nrf2-OE-Keap1,和抑制GOLPH3表达的LNCa P-Nrf2-OE-GOLPH3L、DU145-Nrf2-OE-GOLPH3L,MTT法绘制重载质粒、空载质粒、Keap1过表达和GOLPH3抑制的LNCa P和DU145的生长曲线;
8) 软琼脂细胞集落形成实验分别检测重载质粒、空载质粒、Keap1过表达和GOLPH3抑制的LNCa P组和DU145组细胞集落形成的差异。
结果：
1) DU145胞生长速度较LNCa P细胞生长速度快;
2) Western blot结果显示,Nrf2蛋白在LNCa P细胞中的表达较DU145高;
3) LNCa P细胞内活性氧含量较DU145高;
4) 细胞蜡块免疫组化及Western blot结果显示,Nrf2过表达可降低GOLPH3蛋白在两种前列腺癌细胞中的表达;
5) RT-PCR结果显示,Nrf2过表达可降低GOLPH3 m RNA在两种前列腺癌细胞中的表达;
6) MTT法检测结果显示,Nrf2的过表达可使前列腺癌细胞生长速率明显减慢,Keap1的过表达可使细胞生长速率增快,Keap1对LNCa P-Nrf2-OE的作用比DU145-Nrf2-OE明显,GOLPH3L可使细胞生长速率增快;
7) 软琼脂细胞集落形成实验结果显示,Nrf2的过表达可抑制细胞集落形成,Keap1抑制Nrf2的作用促进细胞集落形成,且Keap1对LNCa P-Nrf2-OE的作用比DU145-Nrf2-OE明显,GOLPH3L显著促进LNCa P-Nrf2-OE和DU145-Nrf2-OE的体外集落形成能力。