一 材料与方法
㈠实验材料
⒈菌种
地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis ）由唐山师范学院微生物教研室提供
⒉培养基
种子培养基 ：蛋白胨1%；酵母抽提物（膏）0.5%；氯化钠 1%；自然pH
发酵培养基 ：蔗糖1%；蛋白胨1%；氯化钠 0.5%； pH7.0
⒊主要试剂
蔗糖、葡萄糖、玉米淀粉、麦芽糖、玉米浆粉、胰蛋白胨、酵母抽提物（膏）、牛肉膏、黄豆饼粉、尿素
⒋仪器设备
控温摇床、高压灭菌锅、电子天平、pH-3C pH测定仪、无菌操作台、紫外分光光度计
㈡ 方法
⒈培养方法
⑴ 菌种活化
将保藏的菌种转接到斜面培养基，37℃培养24h备用。
⑵种子液的制备
取一环活化的菌种，接入装量为 100 mL 种子培养基的250 mL 三角瓶中，37 ℃，160 r/ min ，培养18 h。
⑶ 摇瓶培养
种子液以1%的接种量接入发酵培养基（装液量100ml/250ml三角瓶）中。37℃，160 r/ min，振荡培养 24 h进行单因素的发酵条件研究。
⒉发酵培养基单因素实验
⑴碳源
分别用1%葡萄糖、玉米淀粉和麦芽糖等量替代发酵培养基中的蔗糖制成培养基。采用摇瓶发酵培养条件，24 h后测定发酵液中的活菌含量以确定最佳碳源。
⑵ 氮源
分别用1 %酵母抽提物、牛肉膏、尿素、氯化铵替代基础发酵液 1 %的胰蛋白胨。采用摇瓶发酵培养条件，24 h 后测定发酵液中的活菌含量，以确定最佳氮源。
⑶ 无机盐
分别用 0.5 %硫酸锰、硫酸镁、硫酸亚铁、氯化钙及不加无机盐的空白，替代等量的发酵培养基中氯化钠（0.5%）。采用摇瓶发酵培养条件，24h 后测定发酵液中的活菌总数，以确定最佳无机盐。
㈢ 正交实验设计
将筛选出的最优碳源、氮源、和无机盐3个重要因素，选用3因素3水平L9（33）正交表进行实验，确定发酵培养基配比（以下简称优化培养基），正交实验因素及水平见表1和表2
㈣发酵条件的优化
采用优化培养基配方，对最佳发酵时间、温度、初始pH、接种量进行逐一优化。
㈤测定方法
活菌总数测定采用稀释平板计数法；菌体生长曲线及发酵液生物量采用比浊法测定[9.10]；pH-3C测定仪测定菌液 pH。
二 结果与讨论
㈠ 发酵培养基优化
⑴ 碳源
分别以 1 %葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、和玉米淀粉作为碳源，其他组分均相同进行发酵，测定发酵液中的活菌总数。
葡萄糖、蔗糖和麦芽糖为碳源时地衣芽孢杆菌的生长明显优于玉米淀粉，利用前3种碳源发酵后，地衣芽孢杆菌活菌数超过2.2×1010CFU/ mL。而利用玉米淀粉时其活菌数在 0.9×1010CFU/ mL 以下，说明该地衣芽孢杆菌利用单糖和二糖的能力优于淀粉。该地衣芽孢杆菌生长的最佳碳源是葡萄糖，其次是蔗糖和麦芽糖。
⑵ 氮源
以 1 %葡萄糖为碳源，分别以 1 %尿素、氯化铵、牛肉膏、酵母抽提物、胰蛋白胨为氮源制成发酵培养基。
有机氮源效果要明显优于无机氮源。利用有机氮源发酵后，地衣芽孢杆菌活菌数都超过2.20×1010CFU/mL，而利用无机氮源时的活菌数在 1.0×1010CFU/mL以下，说明该地衣芽孢杆菌利用有机氮源的能力优于无机氮源。地衣芽孢杆菌生长的最适氮源是酵母抽提物，这与酵母抽提物富含氨基酸、小肽、核苷酸、B族维生素等生长因子有关。
⑶ 无机盐
分别以1%葡萄糖和1%酵母抽提物为碳源和氮源，以不加无机盐为空白，在此基础上分别加入0.5%的硫酸锰、硫酸镁、硫酸亚铁、氯化钠及氯化钙。
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