常见问题及对策
培养液PH值变化太快
可能原因
1. CO2 张力不对 。
2. 培养瓶盖拧得太紧 。
3. NaHCO3 缓冲系统缓冲力不足。
4. 培养液中盐浓度不正确 。
5. 细菌、酵母或真菌污染 。
建议解决方法
1. 按培养液中NaHCO3 浓度增加或减少培养箱内CO2 浓度，2.0g/L 到3.7g/L 浓度NaHCO3 对应CO2 浓度为5％ 到10％。
2. 松开瓶盖1/4 圈。
3. 改用不依赖CO2 培养液。加HEPES 缓冲液至10 到25mM 终浓度。
4. 在CO2 培养环境中改用基于Earle′s 盐配制的培养液，在大气培养环境中培养改用Hanks 盐配制的培养液。
5. 丢弃培养物，或用抗生素除菌。
培养液出现沉淀，但pH值不变
? 可能原因
1. 洗涤剂清洗后残留有磷酸盐，将培养基成分沉淀下来 。
2. 冰冻保存培养液。
? 建议解决方法
1. 用去离子水反复冲洗玻璃器皿，然后灭菌。
2. 将培养液加热到37℃，摇动使其溶解如沉淀仍然存在，丢弃培养液。
培养液出现沉淀， 同时pH 发生变
? 可能原因
1. 细菌或真菌污染 。
? 建议解决方法
1. 丢弃培养物，或用抗生素除菌
培养细胞不贴壁
? 可能原因
1.胰蛋白酶消化过度。
2.支原体污染。
3.培养瓶瓶底不干净 。
4.培养液pH值过碱（NaHCO3分解）。
5.消化液或培养液配制错误、过期储存、储存不当。
6.细胞老化（如传代前细胞已汇合导致失去贴附性）。
7.接种细胞起始浓度太低或太高 。
? 建议解决方法
1. 缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度。
2.分离培养物，检测支原体。清洁支架和培养箱。如发现支原体污染，丢弃培养物。
3.注意刷洗，或换用一次性塑料培养瓶 。
4.使用无菌醋酸溶液调整pH值或充入无菌CO2（将培养液敞口放入培养箱也可）。
5.重新配置消化液或培养液 。
6.启用新的保种细胞 。
7.调节最佳接种细胞浓度
悬浮细胞成簇
? 可能原因
1. 培养液中含钙、镁离子 。
2. 支原体污染 。
3. 蛋白酶过度消化使得细胞裂解释 。
4. DNA污染 。
? 建议解决方法
1. 用无钙镁平衡盐溶液洗涤细胞，轻轻吹吸细胞获得单细胞悬液。
2. 分离培养物，检测支原体。如发现支原体污染，丢弃培养物。
3. 用DNase I 处理细胞。
原代细胞培养物污染
? 可能原因
1. 原代培养组织在进入培养前已污染。
? 建议解决方法
1. 培养前用含高浓度抗生素的平衡盐溶液反复冲洗组织。
培养细胞生长减慢
? 可能原因
1. 由于更换不同培养液或血清。
2. 培养液中一些细胞生长必需成分如谷氨酰胺或生长因子耗尽或缺乏或已被破坏。
3. 培养物中有少量细菌或真菌污染。
4. 试剂保存不当 。
5. 接种细胞起始浓度太低 。
6. 细胞已老化 。
7. 支原体污染。
? 建议解决方法
1. 比较新培养液与原培养液成分，比较新血清与旧血清支持细胞生长实验。让细胞逐渐适应新培养液。
2.换入新鲜配制培养液，或补加谷氨酰胺及生长因子。
3.用无抗生素培养液培养，如发现污染，丢弃培养物。或用抗生素除菌。
4.血清需保存在-5℃ 到-20℃。培养液需在2~8℃避光保存。含血清完全培养液在2~8℃保存，并在2 周内用完。
5.增加接种细胞起始浓度。
6.换用新的保种细胞。
7.分离培养物，检测支原体。清洁支架和培养箱。如发现支原体污染，丢弃培养物。
培养细胞死亡
? 可能原因
1. 培养箱内无CO2 。
2. 培养箱内温度波动太大 。
3. 细胞冻存或复苏过程中损伤 培养液渗透压不正确 。
4. 培养液种有毒代谢产物堆积 。
? 建议解决方法
1. 检测培养箱内CO2 。
2. 检查培养箱内温度 。
3. 取新的保存细胞种 。
4. 检测培养液渗透压。
注意：大多数哺乳动物细胞能耐受渗透压为260 – 350mOsm/kg。加入额外试剂如HEPES或药物都有可能影响培养液渗透压。
5. 换入新鲜培养液 。
CO2 培养箱的水盘如何保持清洁？
?定期(至少每两周一次) 以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。
为什么要热灭活血清？
?加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在进行免疫学研究、培养ES细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。
L－谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？
L－谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L－谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L－谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终确定。L－谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。
GlutaMAX-I是什么？培养细胞如何利用GlutaMAX-I？这个二肽有多稳定？
GlutaMAX-I二肽是L－谷氨酰胺的衍生物，将其不稳定的α－氨基用L－丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L－谷氨酰胺供利用。
GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMAX-I二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，L－谷氨酰胺几乎完全降解。
为什么培养基中可以省去加酚红？
酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。
如何用台盼兰计数活细胞？
用无血清培养基把细胞悬液稀释到200－2000个/毫升，在0.1毫升的细胞中加入0.1毫升的0.4％的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色。
冷冻管应如何解冻？
取出冷冻管后， 须立即放入37 ℃水槽中快速解冻， 轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化， 并注意水面不可超过冷冻管盖沿， 否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时， 必须注意安全， 预防冷冻管之爆裂。
细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除DMSO？
除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外， 绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。
可否使用与原先培养条件不同之培养基？
不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基，若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基，细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活。
可否使用与原先培养条件不同之血清种类？
不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源， 所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。
何谓FBS, FCS, CS, HS ?
FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思，两者都是指胎牛血清，FCS 乃错误的使用字眼，请不要再使用。CS(calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血清。
培养细胞时应使用5 % 或10% CO2？或根本没有影响？
一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统，而培养基中NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g 时，细胞培养时应使用10 % CO2；当培养基中NaHCO3 为每公升1.5 g 时，则应使用5 % CO2培养细胞。
何时须更换培养基？
视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。
培养基中是否须添加抗生素？
除于特殊筛选系统中外，一般正常培养状态下，培养基中不应添加任何抗生素。
附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA 浓度？应如何处理？
一般使用之trypsin-EDTA 浓度为0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于-20 ℃，避免反复冷冻解冻造成trypsin 之活性降低，并可减少污染之机会。
悬浮性细胞应如何继代处理？
一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中，稀释细胞浓度即可，若培养液太多时，可将培养角瓶口端稍微抬高，直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶，加入新鲜培养基稀释至适当浓度，重复前述步骤即可。
欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？
欲回收动物细胞，其离心速率一般为300xg (约1,000rpm)，5 - 10 分钟，过高之转速，将造成细胞死亡。
细胞之接种密度为何？
依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。
细胞冷冻培养基之成份为何？
动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5 - 10 %DMSO
(dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意：由于DMSO 稀释时会放出大量热能，故不可将DMSO直接加入细胞液中， 必须使用前先行配制完成。
DMSO之等级和无菌过滤方式之为何？
冷冻保存使用之DMSO 等级， 必须为Tissue culture grade之DMSO(如Sigma D2650)，其本身即为无菌状况，第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于4°C， 避免反复冷冻解冻造成DMSO 之裂解而释出有害物质，并可减少污染之机会。若要过滤DMSO，则须使用耐DMSO 之Nylon 材质滤膜。
冷冻保存细胞之方法？
冷冻保存方法一:
冷冻管置于4℃ 30~60 分钟→ (-20 ℃30 分钟*) → -80 ℃16~18 小时(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 长期储存。
冷冻保存方法二:
冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3 ℃ 至-80 ℃ 以下，再放入液氮槽vapor phase长期储存。-20 ℃不可超过1小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃ 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
细胞欲冷冻保存时， 细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？
冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml vial，融合瘤细胞则以5x106cells/ml vial 为宜。
应如何避免细胞污染？
细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。
如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？
加入相应抗生素或直接灭菌后丢弃之。
支原体(mycoplasma) 污染的细胞， 是否能以肉眼观察出异状？
不能。除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株，无法以其外观分辨之。
支原体污染会对细胞培养有何影响？
支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数，代谢及研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。
培养基的选择？
培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI- 1640做悬浮细胞培养，各种目的无血清培养的首选是AIM V培养基（SFM）。
中国微生物查询网（www.biobw.org）