葡萄球菌选择性琼脂的具体操作流程及注意事项有哪些？
小杨 / 2026-03-19 09:38:22
葡萄球菌选择性琼脂的使用方法遵循微生物实验的标准流程，其核心在于确保无菌操作、正确的样本处理和规范的培养条件。
一、实验原理回顾（简要）
在开始操作前，回顾一下其核心原理能帮助你更好地理解每一步操作的目的：
选择性：培养基中含有高浓度的氯化钠（通常为 7.5%）和抗生素。高盐环境抑制了大多数不耐盐的革兰氏阴性菌和部分革兰氏阳性菌的生长；抗生素则进一步抑制特定类型的细菌，从而为葡萄球菌的生长提供了优势环境。
鉴别性：培养基中添加了甘露醇和指示剂。致病性葡萄球菌（如
金黄色葡萄球菌）能够发酵甘露醇产酸，导致周围培养基 pH 下降，酚红指示剂由红色变为黄色，形成明显的特征性现象。
二、详细使用方法
1、实验材料准备
培养基：购买商品化的葡萄球菌选择性琼脂干粉或成品培养基。
样本：待检测的样本，如食品样品（如牛奶、肉制品）、临床标本或环境样本。
实验器材：
无菌生理盐水或缓冲液（用于稀释样本）。
无菌吸管或移液器、无菌试管、无菌培养皿。
酒精灯、火柴。
恒温培养箱（设定温度为 35-37°C）。
显微镜（用于后续的菌落形态观察和革兰氏染色）。
革兰氏染色液（结晶紫、碘液、95% 乙醇、番红）。
2、操作步骤
A.培养基的准备（若使用干粉）
称量与溶解：按照培养基说明书上的推荐量，准确称取适量的琼脂粉，加入到适量的蒸馏水中。
加热煮沸：将装有琼脂粉和水的容器置于电炉或微波炉中加热，边加热边搅拌，直至琼脂粉完全溶解。
分装：将完全溶解的培养基趁热分装到灭菌的锥形瓶或试管中。分装量不宜过满，一般以能倒出 15-20 mL 培养基制备一个标准培养皿为宜。
灭菌：将分装后的培养基用高压蒸汽灭菌锅进行灭菌。灭菌条件通常为 121°C, 15 磅，15-20 分钟。这一步是为了彻底杀灭培养基中的杂菌。
冷却与凝固：灭菌后的培养基从高压灭菌锅中取出，待其冷却至 50-55°C 左右（手感温热但不烫手）时，即可用于倒平板。
倒平板：
点燃酒精灯，在火焰旁进行所有操作，以保证无菌环境。
轻轻晃动装有冷却后培养基的容器，使其混合均匀。
打开培养皿盖，将适量的培养基（约 15-20 mL）倒入培养皿中，迅速盖好盖子。
将倒好培养基的培养皿轻轻平放，待其在水平台上自然冷却并凝固成固体平板。
凝固后，培养基应呈透明或半透明状，无明显气泡。将平板倒置存放于 4°C 冰箱中，备用。
B.样本的接种与培养
样本处理：
固体样本：如肉制品、面包等，称取 25 g（或 mL）样品，放入含有 225 mL 无菌生理盐水或缓冲液的均质袋或无菌研钵中，进行均质处理，制成 1:10 的稀释液。
液体样本：如牛奶、饮料等，直接取 25 mL（或 mL）样品。
临床样本：如皮肤拭子，将拭子在无菌生理盐水中轻轻挤干，洗脱液即为待接种样本。
系列稀释（可选）：如果样本中菌量可能很高，为了获得合适的菌落密度以便计数，通常需要进行系列稀释。例如，取 1 mL 上述稀释液，加入到 9 mL 无菌生理盐水中，制成 1:100 的稀释液，以此类推。
接种：
用无菌吸管或移液器吸取适量的待接种样本（或稀释液）。
在火焰旁，将样本均匀地滴加或涂布在葡萄球菌选择性琼脂平板的表面。
对于涂布法：使用无菌的玻璃刮铲或 L 型玻璃棒，将样本在平板表面轻轻涂匀，确保样本与培养基充分接触。
对于倾注法（较少用于 MSA）：将融化并冷却后的培养基倒入无菌培养皿，然后加入样本，迅速摇匀，待凝固后培养。
培养：
将接种好的平板倒置放入恒温培养箱中。
设定培养温度为 35-37°C。
培养时间为 18-24 小时。在此期间，葡萄球菌会在培养基上生长繁殖。
3、结果观察与计数
观察菌落形态：培养结束后，取出平板进行观察。
识别葡萄球菌菌落：典型的葡萄球菌菌落呈圆形、凸起、表面光滑、湿润、边缘整齐、颜色为灰白色或淡黄色。
观察特征性现象：
黄色晕圈：如果培养基中含有甘露醇，观察菌落周围是否有黄色晕圈。这是金黄色葡萄球菌发酵甘露醇产酸的标志。
溶血现象：如果培养基中添加了血液（如血琼脂版 MSA），观察菌落周围是否有透明或草绿色的溶血环。金黄色葡萄球菌通常表现为 β- 溶血（完全透明的溶血环）。
计数：
如果需要对葡萄球菌进行定量计数，应选择菌落数在 30-300 个 之间的平板进行计数。
对于不同的稀释度，分别计算每个平板的菌落数。
最终的菌数结果通常以 CFU/g (或 CFU/mL) 表示。
三、关键注意事项
无菌操作：这是整个实验成功的关键。所有接触培养基和样本的器材（吸管、培养皿、刮铲等）都必须是无菌的。操作过程应在酒精灯火焰附近进行，以减少空气中杂菌的污染。
培养基质量：
使用前检查培养基的外观，应无浑浊、无沉淀、无变色。
严格按照说明书的要求进行灭菌和储存。干粉培养基应密封保存在干燥、阴凉处。成品培养基应在有效期内使用，并按照推荐条件储存（通常为 2-8°C 冷藏）。
若培养基出现浑浊、异味或颜色变化，应立即停止使用。
样本处理：
样本的采集和处理应符合相关标准操作规程（SOP）。
对于含有油脂或其他抑制物的样本，可能需要进行适当的稀释或预处理，以避免抑制物影响细菌生长。
接种技术：
接种时应避免样本在平板表面造成过多的流动，以保证菌落的独立性和清晰度。
涂布时力度要适中，避免划破培养基表面。
培养条件：
严格控制培养温度和时间。温度过高或过低、时间过短或过长都可能影响细菌的生长和菌落形态的正常表现。
平板必须倒置培养。这样可以防止冷凝水滴落到培养基表面，冲散菌落，同时也有利于保持培养基的湿度。
结果判断：
葡萄球菌的鉴定不能仅凭菌落形态和特征性现象就下定论，尤其是在样本污染风险较高时。
通常需要进行进一步的确认试验，如：
革兰氏染色：观察细菌的形态（革兰氏阳性球菌，呈葡萄串状排列）和染色性。
生化试验：进行甘露醇发酵试验、凝固酶试验（
金黄色葡萄球菌的重要鉴定指标）、触酶试验等。
自动化鉴定系统：使用 VITEK、MALDI-TOF 等自动化系统进行快速鉴定。
安全防护：
实验操作应在生物安全柜内进行（对于可能含有致病性葡萄球菌的样本）。
操作人员应穿戴好个人防护装备（PPE），如实验服、口罩、手套等。
实验结束后，所有使用过的器材和废弃物都应按照生物安全规定进行妥善处理和灭菌。
四、总结
葡萄球菌选择性琼脂的使用是一个严谨的过程，每一个步骤都需要严格遵守标准操作规程。核心在于通过高盐和抗生素实现对葡萄球菌的选择性，通过甘露醇发酵实现对金黄色葡萄球菌的鉴别。成功的关键在于无菌操作、高质量的培养基和规范的培养与鉴定流程。
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