大鼠肝外胆管上皮细胞的原代分离与培养有哪些注意事项？
小杨 / 2026-02-05 10:44:14
大鼠肝外胆管上皮细胞原代分离与培养难度较高、易污染、易混杂成纤维细胞、易老化，下面按操作流程给出可直接执行的注意事项清单，重点放在“容易踩坑、影响纯度与活力”的环节。
一、术前准备与无菌控制（最关键）
1、全程严格无菌
手术器械、PBS、培养基、消化液均需无菌过滤/高压；操作台、器械、大鼠腹部皮肤严格消毒。
胆管位置深、靠近肠道，极易带入肠道菌，操作要快，尽量不碰肠管。
2、动物选择
推荐：2–4 周龄 SD/Wistar 幼鼠，胆管细但上皮细胞比例高、活力好、成纤维少。
成年鼠（>8 周）结缔组织多、消化难、杂细胞多，不建议新手用。
3、试剂与耗材提前准备
消化酶（胶原酶 IV/胶原酶 Ⅱ + DNase I）现配现用，37℃预热。
培养瓶/皿提前包被：鼠尾胶原 I、纤连蛋白或胶原 + 纤连蛋白混合包被，37℃孵育≥2h 或 4℃过夜，吸走多余包被液，PBS 洗一次再用。
上皮专用培养基提前预热：含 EGF、氢化可的松、胰岛素、转铁蛋白、双抗等。
二、解剖与取材注意事项
1、快速、轻柔分离胆管
开腹后找到肝门→肝总管→胆总管，尽量取肝外段，避免带肝组织。
用显微镊/弯镊轻轻剥离，不要过度牵拉，防止上皮脱落。
2、彻底去除脂肪、结缔组织、血管
肉眼可见的脂肪、淋巴结、血管尽量剔除干净，这些是成纤维细胞主要来源。
胆管外膜尽量剥薄，但不要剪破胆管壁。
3、充分漂洗去血
用含双抗的冷 PBS 反复冲洗胆管腔内外，至少 3–5 次，直到洗液基本无血色。
红细胞会影响消化和贴壁，也增加污染风险。
三、消化与单细胞悬液制备（决定活率与纯度）
1、消化方式选择
推荐：剪碎后胶原酶消化 + 轻柔吹打，比单纯“整段消化”更可控。
常用组合：
胶原酶 IV 0.1%–0.2%（或胶原酶 Ⅱ）
加 DNase I 10–20 μg/mL（减少细胞团块、降低再聚集）
37℃水浴消化，40–60 min，每 10 min 轻弹管壁混匀一次。
2、控制消化时间与强度
消化不足：细胞团块多、难贴壁、活力差。
消化过度：细胞大量死亡、贴壁差、后期易飘。
终点判断：组织块变松散、肉眼可见絮状，即可终止。
3、终止与过滤
用含 10%–20% FBS 的培养基终止消化（血清抑制胶原酶）。
70 μm 细胞筛过滤，去除未消化组织块；必要时再用 40 μm 筛一次。
离心：800–1000 rpm × 5 min，轻柔吸上清，避免吸走细胞沉淀。
四、接种与早期培养（决定纯度）
1、接种密度要偏高
胆管上皮细胞密度依赖性强，太稀不贴壁、不长、易凋亡。
一般一只幼鼠的胆管可接种：
T25 瓶 1 瓶 或 6 孔板 1–2 孔。
2、前 24 h 尽量不扰动
接种后放入培养箱，24 h 内不要移动、不要观察、不要换液。
24 h 后首次换液：轻柔吸走悬浮死细胞、红细胞、未贴壁杂质，这一步能显著提高纯度。
3、抑制成纤维细胞的关键
早期换液策略：
第 1 天换液 → 第 2–3 天再换一次 → 之后每 2 天换液。
成纤维贴壁快但早期多悬浮/半贴壁，勤换液可大量去除。
培养基选择：
使用上皮专用培养基（含低血清或无血清 + 添加剂），不利于成纤维生长。
必要时可短期（前 3–5 天）使用低浓度成纤维抑制因子。
五、传代、冻存与复苏注意事项
1、传代时机
原代细胞长到70%–80% 汇合即可传代，不要等到长满、重叠。
一般原代P0–P2用于实验最佳，P3 以后形态、功能明显下降。
2、消化传代要轻柔
用0.25% 胰酶 - EDTA，37℃消化2–4 min，镜下观察细胞变圆、间隙变大立即终止。
吹打次数要少，避免机械损伤；传代比例1:2 或 1:3，不要过度稀释。
3、冻存
冻存液：90% FBS + 10% DMSO，或上皮专用冻存液。
程序降温：4℃ 10 min → -20℃ 30 min → -80℃过夜 → 液氮。
冻存密度要高：1–2×10⁶ cells/mL/ 管。
4、复苏
37℃快速融化，立即加入预热培养基稀释 DMSO，离心去冻存液。
复苏后前 24 h 同样少扰动，24 h 换液去除死细胞。
六、常见问题与质控要点
1、污染（最常见）
表现：培养液浑浊、pH 骤变、镜下见细菌/真菌。
预防：解剖不碰肠管、双抗浓度可适当提高（但不建议长期高双抗），必要时加抗支原体试剂。
2、成纤维细胞过多
表现：出现长梭形、放射状生长细胞，上皮“铺路石”被挤压。
对策：
取材时尽量去外膜；
早期勤换液；
用上皮选择性培养基；
必要时做CK19 免疫磁珠分选，纯度可到 95% 以上。
3、不贴壁/大量飘起
原因：消化过度、包被不好、接种太稀、培养基不合适、温度/CO₂不稳。
对策：
确认包被到位；
提高接种密度；
检查培养箱参数；
改用上皮专用完全培养基。
4、细胞老化、形态变差
表现：细胞变大、扁平、胞质空泡、增殖变慢。
对策：
尽量用P0–P2；
避免反复过度消化；
培养基中维持 EGF、氢化可的松等添加剂。
七、鉴定与纯度确认（建议必做）
形态：典型铺路石样、多边形、紧密排列，无明显长梭形细胞。
免疫荧光/ICC：
阳性：CK19、CK7、Pan-CK、GGT
阴性：α-SMA、Desmin、Vimentin（排除成纤维/平滑肌）
流式：CK19 阳性率建议≥90%，高质量实验要求≥95%。
八、总结成一句话版“避坑口诀”
幼鼠取材快，去脂去膜要干净；
胶原包被提前做，消化时间要适中；
早期勤换除成纤，密度要高少扰动；
原代尽量少传代，P0–P2 最稳定。
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