致泻大肠埃希氏菌增菌与分离的关键步骤与操作流程！
小杨 / 2025-12-29 09:48:02
致泻大肠埃希氏菌（Enterotoxigenic E. coli, ETEC）的增菌与分离是食品微生物学和临床微生物学中的关键步骤。以下是详细的实验方案，涵盖了从样本处理到最终鉴定的全过程。
一、样本处理与前增菌（Enrichment）
增菌的目的是让目标菌在营养丰富的环境中大量繁殖，以便后续的选择性分离。
1、选择合适的增菌培养基
首选：缓冲蛋白胨水 (Buffered Peptone Water, BPW)。
作用：提供基础营养，维持 pH 稳定，为细菌生长提供良好环境。
配方要点：蛋白胨、牛肉浸粉、葡萄糖、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾。
次选/特殊情况：
GN 增菌液 (Gram-Negative Enrichment Broth)：适用于肠道致病菌的增菌，可抑制某些革兰氏阳性菌。
EC 肉汤 (Escherichia coli Broth)：专为
大肠埃希氏菌设计的增菌培养基，含有乳糖、胆盐等成分。
2、操作步骤
取样：按照标准操作程序（SOP），从待测样品（如食品、临床样本）中取样。
接种：将样品均匀接种到 BPW 等增菌培养基中。接种量通常为样品重量或体积的 10%。
培养：
温度：36°C ± 1°C。
时间：18-24 小时。
气体环境：需氧培养。
二、选择性分离培养（Selective Isolation）
这一步的核心是使用含有抑制剂的选择性培养基，抑制杂菌生长，同时允许目标菌生长。
1、选择合适的选择性培养基
首选：麦康凯琼脂 (MacConkey Agar, MAC)。
作用：
选择性：胆盐和结晶紫抑制革兰氏阳性菌生长。
鉴别性：乳糖发酵产酸，使指示剂（中性红）变色。
观察：
大肠埃希氏菌因发酵乳糖产酸，形成红色或粉红色、圆形、湿润、凸起的菌落。
次选/补充：
伊红美蓝琼脂 (Eosin Methylene Blue Agar, EMB)：
作用：伊红和美蓝为指示剂，
大肠埃希氏菌发酵乳糖产酸后，与指示剂结合形成紫黑色并有金属光泽的菌落。
优势：对大肠埃希氏菌的鉴别性比 MAC 更强。
Hektoen Enteric Agar (HE)：适用于沙门氏菌和志贺氏菌的分离，但也能分离
大肠埃希氏菌。大肠埃希氏菌在此培养基上通常为黄色菌落。
2、操作步骤
接种：用无菌接种环或接种针，从增菌后的肉汤中挑取一环菌液，在 MAC 或 EMB 平板表面进行分区划线，以获得单个菌落。
培养：
温度：36°C ± 1°C。
时间：18-24 小时。
气体环境：需氧培养。
三、菌落形态观察与生化鉴定
从分离平板上挑选典型菌落进行形态观察和生化试验，以确认其为大肠埃希氏菌。
1、典型菌落形态
MAC 平板：红色或粉红色，圆形，边缘整齐，表面光滑，湿润。
EMB 平板：紫黑色，有金属光泽。
2、关键生化试验（API 20E 系统或生化管）
生化试验 结果 说明
革兰氏染色 阴性 短杆状，无芽孢，通常成对或短链排列。
乳糖发酵 阳性 产酸（可使指示剂变色）。
吲哚试验 (Indole) 阳性 产生吲哚。
甲基红试验 (Methyl Red) 阳性 产生大量混合酸。
VP 试验 (Voges-Proskauer) 阴性 不产生乙酰甲基甲醇。
枸橼酸盐利用 阴性 不能利用枸橼酸盐作为唯一碳源。
脲酶试验 阴性 不产生脲酶。
注意：
致泻大肠埃希氏菌（ETEC）的生化特性通常与普通大肠埃希氏菌一致，主要区别在于其是否携带产生肠毒素的质粒。因此，生化试验只能证明其为大肠埃希氏菌，不能直接证明其致病性。
四、血清学鉴定（可选但推荐）
血清学鉴定可以确认菌株的血清型，对于溯源和流行病学调查非常重要。
方法：采用玻片凝集试验 (Slide Agglutination Test)。
原理：使用针对大肠埃希氏菌 O 抗原（菌体抗原）和 H 抗原（鞭毛抗原）的特异性诊断血清。
操作：将菌落混悬于生理盐水中，滴加相应的诊断血清，观察是否出现凝集现象。
结果：出现凝集则为阳性，表明该菌株属于该血清型。
五、肠毒素检测（确认致病性）
这是区分致病性大肠埃希氏菌和非致病性菌株的关键步骤。
1、耐热肠毒素 (ST)
检测方法：乳鼠灌胃试验或酶联免疫吸附试验 (ELISA)。
原理：ST 对热稳定，能引起实验动物（如乳鼠）的腹泻和呕吐。
2、不耐热肠毒素 (LT)
检测方法：兔肠段结扎试验或细胞毒性试验。
原理：LT 对热不稳定，能引起兔肠段液体积聚或导致 Vero 细胞病变。
六、总结流程
样本 → 前增菌 (BPW, 36°C, 18-24h) → 选择性分离 (MAC/EMB, 36°C, 18-24h) → 挑取典型菌落 → 生化鉴定 (确认是大肠埃希氏菌) → 血清学鉴定 (确定血清型) → 肠毒素检测 (确认致病性) → 报告结果
关键注意事项
无菌操作：整个实验过程必须严格遵守无菌操作规范，防止样品污染和操作者感染。
培养基质量：使用质量合格、在有效期内的培养基。
培养条件：严格控制培养温度和时间，这对细菌的生长和生化反应结果至关重要。
安全防护：由于涉及致病菌，所有实验操作都应在生物安全二级（BSL-2）或更高等级的实验室中进行，并佩戴适当的个人防护装备（PPE）。
北京百欧博伟生物技术有限公司的
微生物菌种查询网提供微生物菌种保藏、测序、购买等服务,是中国微生物菌种保藏中心的服务平台，并且是集微生物菌种、菌种,ATCC菌种、细胞、培养基为一体的大型微生物查询类网站，自设设备及技术的微生物菌种保藏中心！欢迎广大客户来询！
下载附件
上一篇：葡萄球菌选择性琼脂的实验原理及实验中的典型现象！
下一篇：兔心脏微血管内皮细胞的应用有哪些？体现在哪些方面？