大肠菌群初发酵与复发酵试验的方法及常见问题与解决方案！
小杨 / 2025-12-19 09:34:37
大肠菌群的初发酵与复发酵试验是食品、饮用水等样品中大肠菌群检测的经典方法，核心原理是利用大肠菌群发酵乳糖产酸产气的生理特性，通过两步试验完成定性与定量判定，以下是完整的操作知识包。
一、试验原理
大肠菌群是一群革兰氏阴性、无芽孢、需氧或兼性厌氧的杆菌，在 36℃左右的条件下，能在 24～48h 内发酵乳糖，产生乳酸等有机酸和二氧化碳等气体。
初发酵：通过乳糖胆盐培养基（含胆盐可抑制革兰氏阳性菌生长），初步筛选出能发酵乳糖产气的可疑阳性管。
复发酵：对初发酵的可疑阳性管进行分离培养和再次发酵验证，排除假阳性，确认大肠菌群的存在。
二、操作方法
（一）样品前处理
根据样品类型（固体、液体）进行不同处理：
液体样品（如饮用水、饮料）：摇匀后直接取样，或用无菌生理盐水稀释。
固体样品（如食品）：称取 25g 样品，加入 225mL 无菌生理盐水，均质制成 1:10 的匀液，再根据污染程度做系列稀释（如 10⁻²、10⁻³ 等）。
（二）初发酵试验
选取 3 个适宜的稀释度，每个稀释度接种 3 管乳糖胆盐发酵管，每管接种 1mL 稀释液（或原液）。
将接种后的发酵管置于 36℃±1℃ 培养箱中，培养 24h±2h。
观察结果：
若发酵管内产酸（培养基由紫色变为黄色）且产气（杜氏小管内有气体），记为初发酵可疑阳性；
若无产气或只产酸不产气，记为阴性。
若 24h 未产气，可继续培养至 48h，仍无气体则判定为阴性。
（三）复发酵试验
挑取初发酵可疑阳性管中的培养物，划线接种于 伊红美蓝琼脂（EMB） 平板上。
置于 36℃±1℃培养箱，培养 18～24h。
观察菌落形态：大肠菌群在 EMB 平板上的典型菌落为 紫黑色、有金属光泽，或呈淡紫红色、中心较深的菌落。
从典型菌落中挑取 2～3 个，接种到乳糖发酵管中，36℃±1℃培养 24h±2h。
若乳糖发酵管产酸产气，则判定为复发酵阳性，确认存在大肠菌群；反之则为阴性。
三、注意事项
无菌操作：全程需严格无菌，避免环境中的杂菌污染样品或培养基，否则会导致假阳性。
培养基质量
乳糖胆盐发酵管的 pH 需准确（约 7.4），胆盐浓度要适宜，过高会抑制大肠菌群生长，过低则无法有效抑制革兰氏阳性菌。
EMB 琼脂需新鲜配制，避免出现干裂或污染。
培养条件控制：温度和时间需严格遵守，温度过高或过低会影响大肠菌群的代谢活性，导致产酸产气能力下降。
稀释度选择：需根据样品污染情况选择合适的稀释度，确保至少有一个稀释度的发酵管出现阳性，且阳性管数在 3～6 管之间，便于计数。
菌落挑取：复发酵时优先挑取典型菌落，若无可典型菌落，可挑取可疑菌落进行验证，避免漏检。
四、应用范围
食品安全检测：用于各类食品（如肉制品、乳制品、糕点、果蔬等）的大肠菌群筛查，判断食品是否受肠道致病菌污染。
饮用水与水质监测：检测饮用水、水源水、污水等的大肠菌群数量，评估水质卫生状况。
环境样品检测：监测土壤、空气等环境样品中的粪便污染程度。
五、常见问题及解决方案
常见问题 原因分析 解决方案
初发酵假阳性（非大肠菌群产气） 革兰氏阳性菌未被胆盐完全抑制，或样品中存在其他发酵乳糖的杂菌 提高胆盐浓度；严格控制培养温度和时间；复发酵时严格筛选典型菌落
初发酵假阴性（大肠菌群未产气） 稀释度过高，接种的菌量不足；胆盐浓度过高抑制目标菌；培养时间不足 选择合适的稀释度；调整培养基胆盐浓度；延长培养至 48h 观察
EMB 平板上无典型菌落 接种量过少；培养温度不适；菌落未长出 增加接种量；校准培养箱温度；延长培养至 24h
复发酵阳性率低 挑取的菌落非大肠菌群；乳糖发酵管质量问题 优先挑取紫黑色有金属光泽的典型菌落；验证乳糖发酵管的有效性
六、结果计算
根据复发酵阳性的管数，查阅大肠菌群最可能数（MPN）检索表，计算每克（或每毫升）样品中的大肠菌群 MPN 值。
北京百欧博伟生物技术有限公司的
微生物菌种查询网提供微生物菌种保藏、测序、购买等服务,是中国微生物菌种保藏中心的服务平台，并且是集微生物菌种、菌种,ATCC菌种、细胞、培养基为一体的大型微生物查询类网站，自设设备及技术的微生物菌种保藏中心！欢迎广大客户来询！
下载附件
上一篇：泡盛曲霉烟色变种对土壤的改良作用体现在哪些方面？
下一篇：工作菌株特性稳定的核心是什么，具体体现在哪些方面？