IM-9 人外周血B淋巴细胞的转化方法与实验步骤！
小杨 / 2024-07-12 09:14:32
EB 病毒的特性之一是能使人外周血B 淋巴细胞转化，使其成为连续分裂，永久生存的类淋巴母细胞样细胞，即永生化细胞。每一永生细胞株都保存了原来提供血样个体的完整基因组，为研究世界上不同人种、不同民族的遗传结构，不同个体、不同人群对疾病的易感性，特别是对家族性遗传疾病和地方性疾病的易感性，提供了宝贵的遗传资源。
一、细胞简介
规格：1×10⁶Cells/T25培养瓶
细胞信息：IM-9
细胞别称：IM 9; IM9; GM04680
种属：人
组织来源：外周血，B淋巴细胞
生长特性：悬浮细胞
细胞形态：淋巴母细胞样
生物安全等级：2 [Cells contain Herpesvirus]
生长培养基：RPMI-1640 ＋10% FBS ＋1% P/S
推荐传代比例：1:2-1:4
推荐换液频率：2~3次/周
倍增时间：~45 hours
冻存条件
冻存液：55% 基础培养基+40%FBS+5%DMSO
温度：液氮
培养条件
气相：空气，95%；CO2，5%
温度：37℃
用途：研究
注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用（产品信息以出库为准）
二、材料与设备
1、无菌材料
细胞培养瓶T25 、T75, 冻存管，一次性小滤器，一次性离心管15ml 、50ml, RPMI1640, 青／链霉素，肝素，胎牛血清，HEPES, 淋巴细胞分离液，环抱素A, EB 病毒，PHA, 二甲亚砜，冻存液，防护手套。
2、设备
二级无菌操作柜、CO2 培养箱、4℃ 冰箱、－20℃ 冰箱、－70 °C 冰箱、离心机。
三、实验步骤
1、静脉取血3~4ml，加等量RPMI1640 （每毫升培养液含青霉素100U/链霉素100μg) 稀释血液，混匀。
2、15ml 离心管加4ml 淋巴细胞分离液，将稀释好的血液缓缓地加到淋巴细胞分离液液面上。
3、离心，每分钟2500 转离心30min，或每分钟3000 转离心25min。
4、淋巴细胞分离液液面上有一层白膜（即淋巴细胞），将白膜层轻轻吸出。移入15ml 离心管内。
5、用RPMI 1640 （每毫升培养液含青霉素100U/链霉素100μg) 清洗3 次。
6、第三次清洗完成后，弃去上清液把细胞轻轻悬起，加2ml 的RPMI1640完全培养液、1.2ml EB 病毒、0.4ml 环玸素A 、0.2mlPHA 把细胞轻轻混匀，然后分2 个细胞培养瓶，A、B 两条线进行培养， 37°C培养箱，无需CO2
7、24h 后镜下观察，如细胞明显增大并聚团，悬浮生长，则说明细胞转化成功。
8、每隔1~2d 少量补液，当瓶内培养液量达到2/3 时，就需要半量换液，从培养瓶中取出体积的1/2 量或更多一点的培养液弃掉，加入等量的完全培养液。
9、细胞冻存，当细胞量达到1 x107个时就可以冻存，每冻存管细胞量1 x 106~ 1.2×106。冻存前1d 需换新鲜培养液。
10、细胞放入冻存管后，用棉花把冻存管包裹约2 寸厚放入－70℃冰箱， 24h后放入液氮罐中。
四、EB 病毒的制备
1、复苏B-958 细胞， 37℃ 水浴中解冻， 用10ml PBS 洗1 次，弃去上清液。
2、将细胞溶解于 8ml 的RPMl1640 宪全培养液中，接种于T25 细胞培养瓶中。
3、每隔1 ~2d 补充一定数量的培养液， 直至达到所需的毫升数时，饥饿4~7d, 收集上清液。
4、于－70℃及37℃ 反复冻融3 次。
5、以每分钟1500 转的速率离心15min 。
6、过滤( 0.22μm ）。
7、分装1.5~ 10ml,，-70 ℃ 冰箱保存备用。
五、试剂的配制
1、抗生素的配制 青霉素和链霉素， 一般配制的浓度为10000U/ml 和10 000μg/ml ，用无菌的D-hanks 溶液或生理盐水溶解，分装小瓶， 5ml／瓶，－20℃冰箱保存备用。用时每1 00ml 培养液加1ml 双抗（每毫升培养液含音霉素100U/链霉素100μg )
2、抗凝药 一般采用每毫升全血加25U 肝素抗凝。市售肝素每2ml 含12500U,取肝素0.4ml (2 500U) 加无菌生理盐水至10ml （浓度为250U/ml ), 分装，放4℃ 冰箱保存备用。每毫升全血加0. 1ml 浓度为250U/ml 的肝素。
3、1mo/L HEPES 称HEPES 粉末23.85g, 溶解在80ml 三蒸水中， 用1mol/L的NaOH 调pH 至7.0, 定容至100ml ，过滤除菌，分装小瓶， 4℃冰箱保存备用。
4、环孢素A 每支5ml 含250mg。将5ml 环孢素A 分装小瓶，放4℃ 冰箱保存备用。使用时取20μl 的原液加入50ml 的RPMI 1640 内，配成20μl/ml ，分装0.4~0.8ml 一管，-20℃ 冰箱保存备用。
5、PHA 进口试剂、国产试剂均可， 10mg PHA, 加生理盐水5ml 溶解， 分装小瓶， 4℃冰箱保存备用（使用浓度为50μg/ml ) 。
6、胎牛血清 Gibco 或Hyclone 公司生产的优质胎牛血清， 56℃灭活30min。
7、RPMI1640 完全培养液的配制RPMI 1640 、15％胎牛血清、1％双抗、18mmol/L HEPES。
8、转化用培养基的配制 2ml RPMI 1640 完全培养液、1.2ml EB 病毒、0.4ml环孢素A、0.2mlPHA （第一次转化使用）
9、冻存液的配制 95％的胎牛血清、5％的二甲亚砜，分装，－20℃ 冰箱保存备用。使用时1ml 可用于冻存1 管。
六、小结
I、在细胞建株时，应分A 、B 两条线进行培养。
2、第一次转化时，培养液的pH 应为6.8~7.2 。
3、整个实验过程均需要戴手套进行。
4、为控制污染，应用二级无菌操作柜进行。
5、在丢弃与转化淋巴细胞及培养液接触的所有材料前，必须进行消毒。
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