微生物的诱变和突变回复试验原理与操作步骤！
小杨 / 2024-03-08 08:44:54
一、实验原理
紫外线是一种最常用的物理诱变因素，它的主要作用是使DNA双链中的两个相邻的嘧啶核苷酸形成二聚体，并阻碍双链的解开和复制，从而引起基因突变，最终导致表形的变化，如产生色素能力的消失，丧失合成某种氨基酸的能力，以及抗药性的变化等。紫外线照射后造成的DNA损伤，一般在可见光照射下，由于光激活酶的作用，可将嘧啶二聚体解开，使其恢复正常，这称为光复活作用。为避免光复活，当用紫外线进行诱变处理时及处理后的操作都应在红光下进行，并且应将微生物在黑暗的条件下进行培养。
亚硝基胍（NTG）是一种挥发性的烷化剂，具有很强的诱变作用，它的作用机制主要是引起NTGDNA链中G：
C——A：T的转换，它的杀菌作用虽很低，但在存活菌中突变率很高。故成为超级诱变剂。
艾姆氏试验的基本原理是利用鼠伤寒沙门氏菌的组氨酸营养缺陷型（his-）菌株发生回复突变性能来检测物质的诱变及致癌性能，此菌株在不含组氨酸的基本培养基上不能生长，但遇有诱变性能的物质后可发生回复突变，因而在基本培养基上也能生长，形成肉眼可见的菌落，因此可以在短时间内，根据回复突变发生的频率来判定该物质是否具有诱变或致癌的性能。由于有些被检测的致癌剂需要哺乳动物肝细胞中的羟化酶系统激活后方能显示致突变物的活性，所以在进行试验时还需要加入哺乳动物肝细胞内微粒体的酶作为体外活化系统（S-9混合液），提高阳性物的测出率。所以艾姆氏试验也称鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体试验。
二、实验步骤
（一）紫外线的诱变作用
1、菌悬液的准备
（1）将1299菌株转接完全培养基斜面，32℃培养24小时。
（2）自斜面取一接种环菌接与20ml/250 ml三角瓶的肉汤培养基中，32℃培养18小时。
（3）取培养液离心3000 rpm离心15分钟，弃去上清液，用生理盐水洗菌体两次，再加适量的生理盐水。显微镜直接计数法，使菌体浓度为108个/ml。
2、诱变处理
（1）吸取上述无菌液10mL于无菌平皿中（皿内放一搅拌子，下为磁力搅拌器），放在15W紫外灯下,距离28.5cm照射60秒，取出放在红灯下，将上述经诱变处理的菌悬液以10倍稀释法，具体可按估计的存活率进行稀释。
（2）取各稀释率下的菌液0.1 ml接于肉汤培养基中，用黑纸包好，32℃培养48小时。
3、淘汰野生型
（1）取肉汤培养基3000 rpm离心15分钟，以生理盐水洗涤两次，加到5mL无氮培养基饥饿培养4~6小时。
（2）加入与无氮培养基等量的二倍氮培养基，培养3~4小时再加青霉素，使青霉素的最终浓度为200单位/毫升。放置3小时。
（3）取上述菌液0.1毫升涂于完全培养基平板上，32℃培养8小时。
4、营养缺陷型菌株的检出
（1）准备完全培养基和基本培养基平板各三个。将划有若干小格并编号的圆形纸贴到平板的背面。
（2）用无菌牙签选取菌落，分别接种于基本培养基和完全培养基的相应位置，32℃培养24小时。
（3）在完全培养基上生长而在基本培养基上不生长的菌落，转接在完全培养基斜面上，32℃培养24~48小时。
5、营养缺陷型类型的鉴定
（1）营养缺陷型分为氨基酸、核酸碱基、维生素三大类物质。
（2）将待测菌株制成细胞悬液，浓度为108个/ml。
（3）制作基本培养基混菌平板。
（4）待冷凝后分为三个区，标明氨基酸，碱基，维生素，用接种针将相应物质放在各区中间。
（5）37℃培养24小时，观察生长情况，哪个区生长，就说明缺陷型菌株需要哪类物质。
6、营养缺陷型具体营养要求的鉴定
（1）将待测菌株制成细胞悬液，浓度为108个/ ml。
（2）制作基本培养基混菌平板。
（3）对于具体氨基酸缺陷型的鉴定，可先将各种氨基酸分为6组，如表1，将待测平皿分为六区，分别将6组氨基酸点在六区中央位置，30℃培养24小时，观察生长谱（表2）即可确定具体所需要的营养物质。
（4）核酸碱基缺陷型的鉴定（只做4种物质），将待测平皿分为四区，在中央位置分别点上，黄嘌呤、腺嘌呤、鸟嘌呤，次黄嘌呤，37℃培养24小时，观察生长情况，即可确定具体所需营养物质。
7、复测
经上述步骤确定的各菌株的营养要求，再以所确定的纯一的营养物质所配制的补充培养基复测一次，如果在补充培养基上生长，在对照的基本培养上不生长，则该菌无疑是这种物质的缺陷型。
（二）NTG对谷氨酸棒杆菌1299的诱变效应
1、制备含菌平板
（1）将活化的斜面菌种挑一环接种于5ml的肉汤培养基中，37℃培养过夜。
（2）次日，按5％接种量取上述菌液于肉汤培养基中，37℃培养6－7h。
（3）取0.2mL菌液于完全培养基平板上，用无菌涂棒将菌液均匀的涂满整个平板表面，倒置培养2h。
2、诱变处理
在上述含菌平板的中央和其他部位放少许NTG结晶，然后将培养皿倒置于37℃恒温箱中，培养24h。
3、增殖培养
放有NTG药物的周围有一透明的抑菌圈，紧靠抑菌圈有一个生长较密集的生长圈，用接种环挑取该处菌苔于装有20mL肉汤培养生物科学与工程系微生物学教学研究室基的三角瓶中，于37℃恒温箱中，培养过夜，使诱变后的突变体进行繁殖，以增加菌数。
4、淘汰野生型
（1）培养菌液：取增殖后的菌液5mL于无菌离心管中，3500r/min离心10min，倒去上清夜，再用生理盐水洗涤两次，离心，去上清液后的约1/10菌液接种到5mL无氮基本培养基中培养12h。
（2）加青霉素：取上述菌液5mL加到5mL高渗培养液的三角瓶中，再加入青霉素，使最终浓度约为500单位/mL，再置于37℃恒温箱中继续培养6h，离心，弃去上清夜，重新悬浮于5mL无氮基本培养基中置冰箱保存。
（3）涂布平板：取上述培养液的原液和10－1、10－2的稀释液各0.1mL，分别涂布于完全培养基平板上，置于37℃恒温箱中继续培养24h，然后选取合适的平板（约长有50－200个菌落）用作营养缺陷型的检查（如无合适平板，可取保存于冰箱中经青霉素处理过的菌液再行稀释、涂布）。
5、缺陷型的检出
同紫外线诱变处理的缺陷型的检出。
(三)艾姆氏试验检测突变回复
1、组氨酸营养缺陷型(his+)鉴定
基于菌株只能在含组氨酸的培养基上生长、无组氨酸的培养基上不能生长的原因,将下层培养基融化,冷却至50℃左右,倒入4个培养皿内,冷凝后倒置过夜制成底层平板。从测试菌株TA100及对照菌株斜面各取一环分别接入肉膏蛋白胨培养液内，37℃，培养16~24h后离心，取菌体并用生理盐水洗涤3次，然后制成菌悬液（浓度1~2×109/mL）。取氯化钠琼脂融化并冷却至45℃左右，保温，各管加0.1mL菌液,每个菌株做两管,迅速摇匀并倒在底层平板上铺匀.在各培养皿背面用记号比标出1,2,3三点.翻转平皿,打开皿盖,在“1”处加微量的组氨酸颗粒,“2”处滴加组氨酸-生物素混合液1小滴,“3”处不加作为对照。37℃，培养2天，观察结果，要求结果为检测菌株为组氨酸-生物素缺陷型。
2、亚硝基胍致突变效应的检测
（1）自发回复突变对照
将下层培养基融化后倒入平皿，制成底层平板。上层培养基融化后冷至45℃左右，加0.1mL菌悬液、0.5mLS-9混合液,不加待测样品液。经37℃培养48h后，观察在下层平板上长出的菌落表示为该菌自发回复突变后生成。记录并算出每组平皿菌落平均数/皿，以Rc表示。
突变率（MR）=每皿诱变菌落均数（Rt）/每皿自发回复突变菌落均数（Rc）
只有突变率〉2才认为样品属艾姆氏试验阳性。当试验样品浓度达到500μg/皿仍未能出现阳性结果时，便可报告该待测样品属艾姆氏试验阴性。
对于阳性结果的样品，其试验结果尚要经统计分析，若计算剂量与回变菌落之间有可重复的相关系数，经相关显著性检验，最后才能确认为阳性。
（2）阴性对照
为说明样品本身确为艾姆氏试验阳性而与配制样品液所用的溶剂无关，所以阴性对照是采用配制样品时的溶剂。
3、亚硝基胍致突变效应的检测
取测试菌珠1管接肉膏培养基活化，37℃，培养16~24h后离心，将菌体用生理盐水洗涤3次，最后配成浓度为1~2×109/mL菌悬液备用.融化下层培养基并倒入6套平皿制成平板,用记号笔作好标记.做1μg、5μg、10μg三种浓度,每浓度每菌重复两皿。取上层培养基6管融化并冷却至45℃左右，标记各管1~6号。每管加TA100菌悬液0.1mL、0.5mLS-9混合液到1~6管.迅速摇匀后,倒在底层平板上,待凝固后在每皿中央放置1片直径为6mm无菌滤纸片。在1、2各皿的滤纸上滴加浓度为50μg /mL的NTG0.02mL,在3、4各皿滤纸滴加250μg NTG0.02mL,在5、6各皿滤纸滴加500μg NTG0.02mL,即终浓度为1μg、5μg、10μg。37℃，培养48h观察结果。
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