KMST-6细胞系人胚成纤维细胞的培养及应用研究！
小杨 / 2024-01-24 08:29:16
一、背景
KMST-6细胞系人胚成纤维细胞的保存条件是低温避光，并且该细胞系的生长方式是贴壁生长，需要通过更换培养基来保持细胞的健康生长。这种细胞系可以通过传代的方式来扩增细胞数量，以适应不同的实验需求。
1)复苏KMST-6细胞系人胚成纤维细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。
将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2)KMST-6细胞系人胚成纤维细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。
d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。
3)KMST-6细胞系人胚成纤维细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。
下面T25瓶为例；
a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。
b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。
c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
三、应用
用不同浓度的硫酸铍作为受试物染毒KMST-6细胞系|人胚成纤维细胞,通过对靶细胞形态学变化、细胞毒性、遗传毒性、相关癌基因和抑癌基因蛋白表达的检测,探讨硫酸铍对体外培养的人胚肺成纤维细胞的恶性转化机制。为研究铍及其化合物致肺癌的机制提供一定的科学理论依据。为铍及其化合物所致职业危害的早期诊断和高危人群的监护提供重要的依据。
方法：采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法观察硫酸铍(终浓度分别为0.2μmol/L、2.0μmol/L、20.0μmol/L、100.0μmol/L、200.0μmol/L)对KMST-6细胞系|人胚成纤维细胞的细胞毒性;用单细胞凝胶电泳(SCGE)和微核试验测定硫酸铍对人胚肺成纤维细胞的遗传损伤情况。用不同浓度的硫酸铍对人胚肺成纤维细胞重复染毒(染毒24h后,终止染毒48h,再染毒24h)后,正常培养,分别传至第3、6、9代,观察靶细胞的形态学变化、癌基因蛋白(C-myc、H-ras蛋白)表达水平的改变和抑癌基因P16的异常甲基化。通过观察细胞形态变化、细胞生长速度的比较和转化细胞恶性程度测试(ConA凝集试验),对转化细胞进行生物学性状鉴定。
结果：
(1)MTT比色法结果显示:硫酸铍重复染毒KMST-6细胞系|人胚成纤维细胞后,终浓度20.0200.0μmol/L硫酸铍染毒组对人胚肺成纤维细胞生长具有明显的抑制作用,其OD值与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05),其它浓度染毒组吸光度值虽与对照组比较差异无统计学意义,但对细胞增殖均有一定的抑制作用,并呈现一定的浓度依赖效应(r=-0.685,P<0.01)。
(2)遗传毒性情况:用硫酸铍染毒KMST-6细胞系|人胚成纤维细胞后,均出现DNA链断裂损伤,三个染毒组DNA损伤的测定指标(尾长、尾部DNA百分含量、尾矩和Olive尾矩)与对照组间差异均有显著性(P﹤0.05,P﹤0.01),且具有明显的剂量反应关系(rTL=0.840,r Tail DNA%=0.724,rTM=0.791,rOTM=0.851,P<0.05);出现微核率与对照组间差异均有显著性(P﹤0.05,P﹤0.01),且具有明显的剂量反应关系(r=0.830,P<0.05)。
(3)相关癌基因蛋白检测结果:不同浓度硫酸铍染毒KMST-6细胞系|人胚成纤维细胞后,C-myc蛋白的表达在细胞分别传至第3、6、9代时,明显高于对照组,差异有统计学意义(P﹤0.05,P﹤0.01),且具有剂量反应关系(r3=0.755,r 6=0.822,r9=0.792,P<0.01);H-ras蛋白在细胞传至第3代时,虽然与对照组差异无统计学意义(P﹥0.05),当传至第6、9代时,染毒组高于对照组,差异有统计学意义(P﹤0.05,P﹤0.01)。且具有剂量反应关系(r3=0.163,r 6=0.586,r9=0.845,P<0.05,P<0.01)。
(4)抑癌基因P16甲基化的测定:对照组KMST-6细胞系|人胚成纤维细胞中抑癌基因P16表达非甲基化条带,细胞传至第3代时各染毒组细胞中也表达非甲基化条带,细胞传至第6、9代时,除第6代低浓度染毒组表达部分甲基化条带,其它均表达甲基化条带。
(5)细胞体外恶性转化试验结果:实验浓度范围内的硫酸铍可不同程度诱发KMST-6细胞系|人胚成纤维细胞形成转化灶,转化细胞生长失去接触抑制性、饱和密度增大、ConA凝集能力增强等多种细胞发生恶性变的生物学表型改变。
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