一、背景
小鼠前脂肪胚胎成纤维细胞是从3T3细胞（Swissalbino）中经克隆分离得到的连续传代的亚系。该细胞从快速分裂到汇合和接触性抑制状态经历了前脂肪细胞到脂肪样细胞的转变。该细胞鼠痘病毒阴性；可产生甘油三酯，高浓度血清可增强细胞内脂肪堆积。
二、小鼠前脂肪胚胎成纤维细胞培养步骤
1）复苏小鼠前脂肪胚胎成纤维细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。
2）小鼠前脂肪胚胎成纤维细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
对于小鼠前脂肪胚胎成纤维细胞，传代可参考以下方法：
1、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗小鼠前脂肪胚胎成纤维细胞1-2次。
2、加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的*培养基终止消化。
3、轻轻吹打小鼠前脂肪胚胎成纤维细胞，脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4、按5-6ml/瓶补加培养液，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。
3）小鼠前脂肪胚胎成纤维细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，进行离心收集，1000RPM条件下离心8-10分钟，去除上清，按冻存数量加入血清及DMSO，冻存比例为90%FBS+10%DMSO。
三、应用
小鼠前脂肪胚胎成纤维细胞可以用于KRAS对3T3-L1、C2C12细胞增殖、自噬和成脂分化的影响：
研究使用si RNA敲降Kras的表达水平,探究其对3T3-L1和C2C12细胞增殖、自噬、成脂分化和脂质蓄积的影响及作用机制。首先,为探究KRAS对3T3-L1和C2C12细胞增殖能力的影响,本研究利用si-KRAS抑制KRAS表达后,通过Ed U和CCK-8方法检测增殖变化;通过q RT-PCR检测细胞增殖相关基因Mtor、Pcna和Myc的m RNA表达水平的变化。
结果表明,敲降KRAS后,3T3-L1和C2C12细胞增殖比例(分别为对照组的0.89±0.07、0.90±0.05倍)以及CCK-8细胞增殖活力均显著下降(分别为对照组的0.82±0.02倍和0.80±0.02倍);增殖相关基因Mtor、Pcna和Myc的m RNA表达水平也显著下降。
随后,探讨了KRAS对细胞自噬的影响。在抑制KRAS表达后,通过免疫荧光染色检测细胞质内LC3B的表达变化;通过Western blot检测细胞自噬关键蛋白LC3B-II/LC3B-I的表达变化;通过q RT-PCR检测自噬相关基因Beclin 1和Atg7的m RNA表达变化。
相关结果表明,敲降KRAS后,3T3-L1和C2C12细胞内LC3B的荧光强度(分别为对照组的1.78±0.11倍和1.38±0.04倍)及LC3B-II/LC3B-I的水平显著增加(分别为对照组的2.25±0.06倍和1.84±0.14倍),并且,Beclin 1和Atg7的m RNA水平也显著上升。最后,我们探讨了KRAS对3T3-L1和C2C12细胞成脂分化的影响及作用机制。
在敲降KRAS后,本研究通过油红O(ORO)染色、甘油三酯水平检测以及成脂相关基因Dgat1、Scd1、C/ebpβ和Hmgr的m RNA表达水平检测明确了KRAS对成脂分化和脂质蓄积的影响;通过Western Blot方法检测了MAPKs(ERKs、JNKs和p38)、PI3K磷酸化水平的变化;通过分别添加MAPK和PI3K通路的激活剂ANI和740 Y-P,探究KRAS对3T3-L1和C2C12细胞成脂的潜在作用机制。
结果表明,抑制KRAS表达后,细胞内甘油三酯水平(分别为对照组的1.24±0.02倍、1.24±0.01倍)、ORO OD520值以及Dgat1、Scd1和C/ebpβm RNA表达水平显著增加,ERK1/2、JNK1/2/3、p38以及PI3K的磷酸化水平显著下降。
并且,MAPK通路激活剂ANI可以显著下调由抑制KRAS引起的甘油三酯水平的上升,而740 Y-P对敲降KRAS引起的甘油三酯水平变化则没有下调作用,反而进一步加强了脂质蓄积。
综上,本研究表明KRAS可以调控3T3-L1和C2C12细胞增殖、自噬和成脂分化。研究结果有助于从分子水平解析脂肪的形成和积累的过程及机制,从而为调控肉类营养和成分、提升肉质提供了理论依据。
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