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结核分歧杆菌的实验室诊断与微生物学检查法!
小杨 / 2022-11-24


结核分歧杆菌(M.tuberculosis),俗称结核杆菌,是引起结核病的病原菌。可侵犯全身各器官,但以肺结核为最多见。结核病为重要的传染病。据WHO报道,每年约有800万新病例发生,至少有300万人死于该病。我国建国前死亡率达200-300人/10万,居各种疾病死亡原因之首,建国后人民生活水平提高,卫生状态改善,特别是开展了群防群治,儿童普遍接种卡介苗,结核病的发病率和死亡率大为降低。但应注意,世界上有些地区因艾滋病、吸毒、免疫抑制剂的应用、酗酒和贫困等原因,发病率又有上升趋势。

一、实验室诊断

1、结核菌素试验

结核菌素试验是应用结核菌素进行皮肤试验来测定机体对结核分枝杆菌是否能引起超敏反应的一种试验。

(1)结核菌素试剂 以往用旧结核菌素(old tuberculin,OT)。系将结核分枝杆菌接种于甘油肉汤培养基,培养4~8周后加热浓缩过滤制成。稀释2 000倍,每0.1ml含5单位。都用纯蛋白衍化物(purified protein derivative,PPD)。PPD有二种:人结核分枝杆菌制成的PPD-C和卡介苗制成的BCG-PPD。每0.1ml含5单位。

(2)试验方法与意义 常规试验分别取2种PPD 5个单位注射两前臂皮内,48~72h后红肿硬结超过5mm者为阳性,≥15mm为强阳性,对临床诊断有意义。若PPD-C侧红肿大于BCG-PPD侧为感染。反之,BCG-PPD侧大于PPD-C侧,可能系卡介苗接种所致。

阴性反应表明未感染过结核分枝杆菌,但应考虑以下情况:①感染初期,因结核分枝杆菌感染后需4周以上才能出现超敏反应;②老年人;③严重结核患者或正患有其他传染病,如麻疹导致的细胞免疫低下;④获得性细胞免疫低下,如艾滋病或肿瘤等用过免疫抑制剂者。为排除假阴性,国内有的单位加用无菌植物血凝素(PHA)针剂 ,0.1ml含10μg作皮试。若24h红肿大于PHA皮丘者为细胞免疫正常,若无反应或反应不超过PHA皮丘者为免疫低下。

2、结核菌γ干扰素释放试验

细胞免疫介导的结核菌γ干扰素释放试验(T-cell interferon gamma release assays,TIGRA,又称IFNGRA或GRA)是近年来采用酶联免疫吸附测定(ELISA)或酶联免疫斑点(ELISPOT)法定量检出受检者全血或外周血单个核细胞对结核分枝杆菌特异性抗原的IFN-γ检测释放反应,用于结核菌潜伏感染的诊断。IFN-γ为Thl细胞分泌的一种细胞因子,不但能够反映机体结核的Thl细胞免疫情况,还与体内结核菌的抗原含量密切相关。被结核分枝杆菌抗原致敏的T细胞再遇到同类抗原时能产生高水平的IFN-γ,因此被用于结核潜伏感染的诊断。

美国FDA已批准的基于ELISA的QuantiFERON-TB(GIT-G)和欧洲使用的基于ELISPOT的T-Spot.TB,都是以早期分泌性抗原靶-6(ESAT-6)和培养滤液蛋白-10(CFP-10)为抗原的。其中,QFT-G又出现了一种用试管的改良方法,称为QFT-GIT(QFT-inTube)。ESAT-6和CFP-10都是从短期培养的滤液中分离的低分子量蛋白质,具有良好的免疫原性,而且它们是选自结核分枝杆菌基因组差异区1(region of difference,RD1)基因编码的结核杆菌特异性蛋白。某些TIGRA试验除了上述2种抗原外,还常用TB7.7抗原。TB7.7是结核分枝杆菌基因组差异区13(RDl3)基因编码的结核杆菌特异性抗原。这3种抗原在BCG和绝大部分环境分枝杆菌中都缺失(除外堪萨斯分枝杆菌、海水分枝杆菌和苏加分枝杆菌),因此避免了与卡介苗和大多数非结核分枝杆菌抗原的交叉反应。

TIGRA的敏感性和特异性都强于TsT,特别是在HIV感染者、自身免疫性疾病、老人和幼儿等免疫力低下人群的检测中。全球有约1300万人共同感染了HIV和结核杆菌。感染HIV的LTBI由于免疫缺陷,更容易从潜伏感染发展为活动性肺结核。Jiang等对BCG计划接种区域的100个HIV共感染患者用T-Spot.TB检测,结果显示T-Spot.TB对于有过BCG接种历史的HIV共感染的LTBI检测比TsT更敏感快速,而且特异性高。Balcells等发现,QFT-G比TST在诊断HIV的LTBI时更少受免疫抑制的影响。Stephan等发现,QFT-G和T-Spot.TB在检测HIV患者的LTBI时比TST更敏感。QFT-G和T-Spot.TB的协同性很差,对于不同CD4细胞数量的患者有不同的结果。Aichelburg等发现,QFTGIT可以用于HIV-1感染者的活动性肺结核检测。

肿瘤坏死因子α(TNF-α)是一种促炎细胞因子,在多种自身免疫性疾病中起重要的病理作用。但是,抗TNF-α的治疗会导致潜伏性肺结核转变为活动性肺结核,而自身免疫性疾病患者由于免疫抑制。TST容易产生假阴性。研究显示,QFT-G和T-Spot.TB在免疫介导炎症疾病(IMID)患者中检测LTBI的敏感性和特异性都比TST高。终末期肾病(ESRD)患者感染结核分枝杆菌的几率比健康人高10~25.3倍。Lee等比较了QFT-G、T-Spot.TB和TsT在ESRD患者中LTBI的诊断,结果显示QFT-G和T-Spot.TB的结果较类似,但TsT和QFT-G、T-Spot.TB的实验结果相差较远。T-Spot.TB的检出率比QFT-G高(分别为46.9%和40.0%)。然而,也有研究显示QFT-G由于有许多不确定性结果,因此不能用于类风湿性关节炎LTBI的检测。

Bergamini等应用QFT-G、QFT-GIT和T-Spot.TB技术对496个0-19岁的儿童和青少年LTBI进行检测,结果发现2种QFT检测得出的结果更相似,QFT相对于T-Spot.TB在4岁以下儿童中得到的非确定性结果更多。Chun等研究显示,QFT-GIT比TsT在诊断接种过BCG的儿童中LTBI的特异性更强。

上述研究表明,TIGRA在HIV共感染、自身免疫性疾病和免疫力低下的儿童中,对LTBI的检出率更高。但是,TIGRA存在无法区分活动期和潜伏期结核、需要抽血获取淋巴细胞、要求专业的操作人员和具备相应条件的实验室、样品必须在采集后8h内完成等缺点,现阶段仍未能完全取代TsT。另外,现阶段研究的样本都非常小,也没有诊断LTBI的金标准。因此,对于TIGRA还有待进一步研究。

二、微生物学检查法

结核病的症状和体征往往不典型,虽可借助X线摄片诊断,但确诊仍有赖于细菌学检查。

1、标本

标本的选择根据感染部位。可取痰、支气管灌洗液、尿、粪、脑脊液或胸、腹水。其他肺外感染可取血或相应部位分泌液或组织细胞。

2、直接涂片镜检

标本直接涂片或集菌后涂片,用抗酸染色。若找到抗酸阳性菌即可初步诊断。抗酸染色一般用Ziehl-Neelsen法。为加强染色,可用IK(intensified Kinyoun)法染色。将石炭酸复红染色过夜,用0.5% 盐酸乙醇脱色30s,则包括大多结核分枝杆菌L型也可着色。为提高镜检敏感性,也可用金胺染色,在荧光显微镜下结核分枝杆菌呈显金黄色荧光。

3、浓缩集菌

先集菌后检查,可提高检出率。培养与动物试验也必须经集菌过程以除去杂菌。脑脊液和胸、腹水无杂菌,可直接离心沉淀集菌。痰、支气管灌洗液、尿、粪等污染标本需经4% NaOH(痰和碱的比例为1:4,尿、支气管灌洗液和碱的比例为1:1)处理15min,时间过长易使结核分枝杆菌L型与非结核分枝杆菌死亡。尿标本先加5% 鞣酸、5% 乙酸各0.5ml于锥形量筒内静置,取沉淀物处理。处理后的材料再离心沉淀。取沉淀物作涂片染色镜检。若需进一步作培养或动物接种,应先用酸中和后再离心沉淀。

4、分离培养

将经中和集菌材料接种于固体培养基,器皿口加橡皮塞于37℃培养,每周观察1次。结核分枝杆菌生长缓慢,一般需2~4周长成肉眼可见的落菌。液体培养可将集菌材料滴加于含血清的培养液,则可于1~2周在管底见有颗粒生长。取沉淀物作涂片,能快速获得结果,并可进一步作生化、药敏等测定和区分结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌。国内学者已证明结核分枝杆菌L型可存在于血细胞内或粘附于细胞表面。这种患者往往血沉加快,用低渗盐水溶血后立即接种高渗结核分枝杆菌L型培养基能提高培养阳性率。

5、动物试验

将集菌后的材料注射于豚鼠腹股沟皮下,3~4周后若局部淋巴结肿大,结核菌素试验阳转,即可进行解剖。观察肺、肝、淋巴结等器官有无结核病变,并作形态、培养等检查。若6~8周仍不见发病,也应进行解剖检查。

6、快速诊断

一般涂片检查菌数需5x103~4/ml,培养需1x102/ml,标本中菌数少于此数时不易获得阳性结果,且培养需时较长。已将多聚酶链反应(PCR)扩增技术应用于结核分枝杆菌DNA鉴定,每ml中只需含几个细菌即可获得阳性,且1-2d得出结果。操作中需注意实验器材的污染问题,以免出现假阳性。又细菌L型由于缺壁并有代偿性细胞膜增厚,而一般常用的溶菌酶不能使细胞膜破裂释出DNA,以致造成PCR假阴性。用组织磨碎器充分研磨使细胞破裂后,则可出现阳性。有条件的单位使用BACTEC法,以含14C棕榈酸作碳源底物的7H12培养基,测量在细菌代谢过程中所产生的14C量推算出标本中是否有抗酸杆菌,5~7d就可出报告。

近年来国内外研究证明临床各种类型的肺结核患者中40% 左右分离出L型。经治疗的结核病人细菌型消失,L型常持续存在。有空洞患者痰中已不排细菌型者,8% 左右仍可检出L型。故有学者建议将多次检出L型亦作为结核病活动判断标准之一,细菌型与L型 均转阴才能作为痰阴性。

三、防治原则

1、预防

近20年国际组织提出控制结核病主要方法有:①发现和治疗痰菌阳性者;②新生儿接种卡介苗。约 80% 获得保护力。1940年代中国部份城市调查肺结核病死率200/10万以上。解放后卫生条件改善,1973~1977显示病死率已下降至30/10万。但1979年以来全国三次大规模抽样检查疫情下降很慢。1979~1990每年患病率递降率2.8%,痰阳性递降率为3.0%。死亡率19/10万,仍为其他传染病之和的2倍。卫生部要求2000年新生儿卡介苗接种率达90%。据统计新生儿时接种过的人以后的发病率比未接种过的减少约80%。

卡介苗是活疫苗,苗内活菌数直接影响免疫效果,故已有冻干疫苗供应。新的核糖体RNA(rRNA)疫苗已引起关注,但尚处在试验阶段。

2、治疗

利福平、异烟肼、乙胺丁醇、链霉素为第一线药物。利福平与异烟肼合用可以减少耐药性的产生。对严重感染,可以吡嗪酰胺与利福平及异烟肼合用。1g干酪灶或空洞约含结核分枝杆菌106~10。每105~6菌可有1种耐药突变产生,对2种耐药需菌1011,故以2药联合应用为宜。

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