一、材料与方法
1.实验菌株。本实验所采用的研究菌株（羊布鲁氏菌55202，牛布鲁氏菌55008，猪布鲁氏菌55006，绵羊布鲁氏菌55305，犬布鲁氏菌55307，森林鼠布鲁氏菌55224，单增李斯特氏菌54001，小肠结肠炎耶尔森氏菌52301，大肠埃希氏菌44155）分别购于中国工业微生物菌种保藏中心、海洋种布鲁氏菌赠自青岛海洋研究所，细菌培养基购于北京兰博瑞生物技术有限公司。
2.仪器试剂。细菌DNA提取试剂盒：细菌基因组DNA小量纯化试剂盒（宝生物工程（大连）有限公司）；Ex TaqDNA聚合酶、dATP、dUTP、dCTP、dGTP、PCR缓冲液、MgCl2、引物均购自宝生物工程（大连）有限公司。
离心机：Eppendorf F10-uc，德国；微量移液枪：0.5-1000ul，Eppendorf；电泳仪：BIO-RAD，MODEL422，美国；分光光度计：Eppendorf；PCR基因扩增仪（DB80220-26 美国）；凝胶成像仪；PCR基因扩增试剂盒。
3.实验方法
（1）菌株的培养。样品的制备及增菌培养均参照各菌的检验检疫行业标准进行。
（2）细菌基因组DNA的抽提。采用宝生物工程（大连）有限公司生产的DNA提取试剂盒（货号DV810A）并按其操作说明进行。
（3）PCR 反应条件及体系。反应条件：93℃预变性5 min，93℃变性60 s，60℃退火60 s，72℃延伸60 s，进行40个循环，72℃延伸10 min，4℃下保存。
反应体系体积50μL：10×PCR缓冲液（Mg2+ Plus）5μL、引物对（20Pmol/L）各0.5μL、dNTP（2.5mmol/L）4μL、Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.25μL、模板DNA1μL、水补足至50μL。
二、结果与分析
1.DNA提取结果的检测。利用布鲁氏菌肉汤培养基提取模板DNA，提取过程可参照相关细菌DNA提取试剂盒操作说明进行。对于模板DNA提取质量需经琼脂糖凝胶电泳验证，可以判定试验所提取的DNA抽提液是否含有DNA或是否适合于进行PCR扩增，从而可以避免出现检测结果的假阴性。剩余布鲁氏菌肉汤增菌液恒温过夜培养，以备确证试验使用。
部分细菌基因组DNA琼脂糖凝胶电泳结果如图3所示：
1.DL2000 DNA maker 2.海洋种布鲁氏菌 3.猪布鲁氏菌 4.牛布鲁氏菌 5.绵羊布鲁氏菌 6.犬布鲁氏菌 7.森林鼠布鲁氏菌 8.单增李斯特氏菌 9.大肠埃希氏菌 10.小肠结肠炎耶尔森氏菌
2.引物的优化。在查阅相关文献的基础上，我们本着建立一种简便、快速检测方法的原则设计引物。通过对六种布鲁氏菌同源序列进行比对分析，设计了利用PCR可以扩增布鲁氏菌属的通用引物。
引物序列如下：
5，-TGGCTCGGTTGCCAATATTCAA-3，
5，-CGCGCTTGCCTTTCAGGTCTG-3，
3.PCR检测。PCR反应结果见图2所示的琼脂糖凝胶电泳
布鲁氏菌PCR扩增的目的片段为223bp。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1.100bp DNA ladder Marker 2.海洋种布鲁氏菌 3.猪布鲁氏菌 4.牛布鲁氏菌 5.绵羊布鲁氏菌 6.犬布鲁氏菌 7.森林鼠布鲁氏菌
4. PCR产物基因测序结果
以上基因测序结果与已知布鲁氏菌基因序列相同。
5.敏感度试验。将布鲁氏菌研究菌株纯培养物稀释一系列浓度梯度，进行灵敏度试验。由图中可看出，PCR检测限至10-7稀释梯度，方法检测限可达到约0.95pg/ul布鲁氏菌DNA，检测下限大约可检测到19个布鲁氏菌。
1.100bp DNA ladder Marker 2.稀释10-4梯度 3. 稀释10-5梯度 4.稀释10-6梯度 5. 稀释10-7梯度 6. 稀释10-8梯度 7. 稀释10-9梯度 6.特异性试验。其它种属细菌检测结果为阴性。证明本方法所使用引物特异性强，能特异性检出布鲁氏菌，避免其它种属细菌的干扰反应。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1.100bp DNA ladder Marker 2.海洋种布鲁氏菌 3.猪布鲁氏菌 4.牛布鲁氏菌 5.绵羊布鲁氏菌6.犬布鲁氏菌7.森林鼠布鲁氏菌8.单增李斯特氏菌 9.大肠埃希氏菌 10.小肠结肠炎耶尔森氏菌 11.水
7.模拟污染样品试验。结果表明三个浓度菌悬液模拟污染样品，PCR全部扩增出布鲁氏菌特异性产物，检测结果如图所示。
1 2 3 4 5 6 7 8 9
1.100bp DNA ladder Marker 2.海洋种布鲁氏菌 103CFU/ Ml 3.海洋种布鲁氏菌 102 CFU/ mL 4.海洋种布鲁氏菌 10 CFU/ mL 5.牛布鲁氏菌 103 CFU/ mL 6.牛布鲁氏菌 102 CFU/ mL 7.牛布鲁氏菌10 CFU/ mL 8.水