中成药微生物限度检查法中细菌霉菌（酵母菌）计数的方法验证
中国微生物菌种查询网 / 2019-02-13 09:25:42
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按中国药典2005版有关规定，通过测定试验菌回收率建立4种中成药的微生物限度检查方法。经试验发现4种药均有一定程度的抑菌作用，但可通过培养基稀释法消除抑菌作用。确定4种药的微生物限度检查法中细菌计数采用培养基稀释法进行检测，霉菌、酵母菌计数采用常规法即可。
复方槐米胶囊、复方女贞子胶囊、复方苦参胶囊、复方香附胶囊等制剂处方中含有的多味中药材具有抑菌活性成分，可抑制污染微生物的生长，采用培养基稀释法进行验证，可消除其对微生物生长的抑制。
1 试验材料
1.1 样品
复方槐米胶囊，规格：每粒0.4g，批号：050904；复方女贞子胶囊，规格：每粒0.4g，批号：050902；复方苦参胶囊，规格：每粒0.4g，批号：050903；复方香附胶囊，规格：每粒0.4g,批号：050901。以上样品的供样单位、生产单位均为66055部队医院。
1.2 培养基
改良马丁培养基，批号050822；营养肉汤培养基，批号020918；改良马丁琼脂培养基，批号050808；营养琼脂培养基，批号050905；玫瑰红钠琼脂培养基，批号020402。以上培养基均为北京三药科技开发公司生产。
1.3 稀释剂
pH7.0无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液，批号050917，生产单位：北京三药科技开发公司生产；0.9％无菌氯化钠溶液自制。
1.4 试验用菌种
金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]；大肠埃希菌[CMCC(B)44102]；枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]；白色念珠菌[CMCC(F)98001]；黑曲霉[CMCC(F)98003]；以上菌种均来自中国药品生物制品检定所。
2 试验方法
2.1 菌液的制备
金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌35℃培养18～24h后分别用0.9％无菌氯化钠溶液稀释至10－6、10-7、10-5；白色念珠菌25℃培养24～48h后用0.9％无菌氯化钠溶液稀释至10-3；黑曲霉25～28℃培养1周后，用0.9％无菌氯化钠溶液3mL洗下孢子，比浊后，用0.9％无菌氯化钠溶液稀释至10-4备用。
2.2 供试液的制备
取样品10g，置灭菌锥形瓶中，加入pH7.0无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液至100mL，置45℃的水浴振荡器中，混匀，作为1：10供试液备用。
2.3 细菌
霉菌及酵母菌计数方法的验证菌液组：测定所加的试验菌数。试验组：取1:10供试液1mL、50～100cfu试验菌依次加入平皿中，立即倾注相应琼脂培养基20mL，每株试验菌平行制备2个平皿，待凝固后，按规定温度培养24～72h逐日观察结果。样品对照组：取规定量1:10供试液，按菌落计数方法测定样品本底菌数。
离心法为取1:10供试液，取液适量，以500r／min，离心5min，取上清液1mL进行试验，其它试验过程同上
采用培养基稀释法时，取离心后的上清液1mL按设计浓度分别平均注入几个平皿中，其它试验过程同上，同法重复试验3次，结果见表1。
试验组的菌回收率(％)=(试验组的平均菌落数一样品对照组的平均菌落数)÷菌液组的平均菌落数×100％
3 讨论
试验结果表明，对4种中成药的细菌、霉菌及酵母菌计数方法采用常规方法验证，均对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌3株阳性代表菌株有抑制作用，回收率均未达到70％，而改用离心法(500r／min，离心5min)，弃去不溶性药渣，取上清液进行验证试验，对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌2株阳性代表菌株回收率均达到70％以上，采用离心加培养基稀释法1:400的浓度(即1:10的供试液0.5mL／Ⅲ)进行验证试验，只有复方女贞子胶囊的枯草芽孢杆菌回收率未达到70％，采用离心加培养基稀释法1:1000的浓度(即1:10的供试液0.2mL／Ⅲ)进行验证试验，可消除复方女贞子胶囊对枯草芽孢杆菌抑菌活性，4种中成药对白色念珠菌和黑曲霉无抗菌活性，按常规方法验证，回收率均达到70％以上。
经验证确定复方槐米胶囊、复方苦参胶囊、复方香附胶囊、细菌计数可采用离心加培养基稀释法1:400的浓度(即1:10的供试液0.5mL／Ⅲ)进行检测，复方女贞子胶囊细菌计数可采用离心加培养基稀释法1:1000的浓度(即1:10的供试液0.2mL／Ⅲ)进行检测，4种中成药霉菌及酵母菌计数采用常规方法检测。
本试验采用了离心加不同浓度的培养基稀释法，解决了药品中抑菌物质的干扰问题，该法操作简单，能真实、准确、有效地反映药品中污染存活的细菌数，检出率高。
本试验采用了离心加不同浓度的培养基稀释法进行微生物限度检查中细菌、霉菌及酵母菌计数，其阳性菌回收率均高于70％，符合中华人民共和国药典2005版一部有关微生物限度检查方法验证的规定要求。
采用本方法进行离心时，要按规定的转速和时间进行操作，不可任意改变条件，当菌液与药品液加入平皿后应迅速倒入培养基。