百欧博伟生物提醒您在细胞冻存或复苏过程中一定要注意以下几点！
中国微生物菌种查询网 / 2018-12-06 09:13:37
1、不要在细胞状态不好时，进行细胞冻存。如，长的太过了，培养液已经很黄了；细胞可疑污染；细胞已经开始凋亡或崩解；连续培养超过二个月，细胞性状已有改变。应该在增殖旺盛，情况稳定，实验效果良好，复苏后两周内进行细胞冻存。
2、冻存时细胞浓度低于1-5 ×106个/ml，很难复苏成功，应该离心后调整细胞浓度。
3、一定要选择原配的管子和盖子（不同牌子/型号的颜色会有差别），冻存管的盖子一定要拧紧，否则复苏水浴时会渗水，造成污染。
4、尽量选择程序冷冻盒进行细胞冻存。如果没有，应选择厚壁泡沫塑料盒，或塞入大量干棉花。防止放在-80℃的冻存盒，壁太薄，细胞被迅速降温。确保“缓降”。
5、冻存的细胞应尽快转入液氮，不要在-80℃冰箱放置超过一个月。
6、防止找不到或拿错细胞，每只冻存管都应标上细胞的名称，冻存时间，并记录在册。
7、取细胞时应做好防护措施，带好防冻手套，护目镜。细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸。
8、必须在1-2min内使冻存液完全融化，复苏温度太慢，会造成细胞的损伤。如果冻存管的壁较厚，隔热效果较好，可以适当提高水浴温度（37℃~40℃）。二甲亚砜（DMSO）最好选择进口产品。
9、提前预定超净台，减少复苏后插在冰盒里等待的时间。复苏后长时间（1h），还没有加入新的培养液。高浓度DMSO防止胞内形成冰晶，冻存时保护细胞，但复苏溶解后，浸泡时间太久会对细胞有毒性。
10、关于细胞溶解后，是否需要离心的问题，需要根据特定的细胞情况而定。主要有两种方式。一种是解冻后的细胞悬液直接吹打均匀后分装到培养瓶中进行培养，第二天换液（后贴壁后即换液）。因为离心的目的是两个，去除DMSO，去除死细胞，这个是标准流程。但对一般人来说，把握不好离心转速和时间，转的不够活细胞沉底的少，细胞就全被扔掉了，转过了活细胞会受压过大，死亡。此外在操作过程中容易污染。另一种是须离心后，将冻存液倒干净，且一定要倒干净。
11、对于不离心直接加入培养基培养的方法，培养基的加入量是个需要考虑的问题。主要涉及DMSO的浓度，如果你加入培养基太少，DMSO的浓度就会比较大，影响细胞生长。而加入培养基太多，又会影响细胞的贴壁效果。
12、DMSO的浓度在小于5%（也有说1%）的时候对一般细胞没有什么影响。所以如果你的冻存液的浓度是10%DMSO，那么1ml的细胞加入10ml以上的培养基就恰好稀释到了无害浓度。
13、有些细胞复苏后一星期才有起色，切忌要有耐心，不要换液，耐心等待，两周后再做决定。不要复苏三四天后，细胞没有任何动静，认为失败，倒掉所有细胞。
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