非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)主要是指结核分枝杆菌复合群(M.tuberculosis-complex，MTC)和麻风分枝杆菌以外的其他分枝杆菌，迄今已发现160多个种别[1]，同时还有新的种别不断出现。NTM多侵犯有基础肺部疾病、免疫力低下、合并HIV感染的人群引起全身多脏器和组织病变[2]，其中以肺部最为常见。研究显示，NTM感染引起人类疾病的升高趋势已受到关注[3,4]。但由于NTM广泛存在于自然环境中，对常用的消毒剂不敏感，很容易污染未经消毒的患者标本(如痰液)和医疗实验用品，引起假性感染和医源性感染，给临床NTM病的诊疗造成困扰。国外已有NTM肺病与临床相关性方面的研究报道[5,6]，但国内这方面研究较少。为此，本研究对成都市公共卫生临床医疗中心分枝杆菌培养的实验资料进行统计分析，旨在了解NTM的感染耐药情况及其与临床的相关性，为临床提供更有针对性防治和治疗NTM疾病的科学依据。
对象与方法
一、研究对象
菌株来源于2014年1月至2015年12月成都市公共卫生临床医疗中心分枝杆菌实验室接诊患者标本(主要来自四川地区)和各防控督导点送检标本(青羊、锦江、成华、武侯、金牛、龙泉驿、青白江，新都、温江、彭州、都江堰、崇州、邛崃、双流、新津、蒲江、大邑、郫县、金堂、简阳、攀枝花、凉山等地区)。对同一患者多次培养的菌株不进行重复计数。
二、研究方法
1．分枝杆菌培养及菌型鉴定：
分枝杆菌培养采用BACTEC MGIT960系统(美国BD公司)，标本类型包括痰液、纤支镜冲洗液以及各种体液和分泌物标本。MTC与NTM分群主要采用改良罗氏培养基对硝基苯甲酸(PNB)和噻吩羧酸酰肼(TCH)鉴别培养基(珠海贝索生物技术有限公司)进行初步鉴定，同时再经分子生物学TB-DNA (北京博奥生物有限公司)进行MTC与NTM的菌型鉴定。
2．NTM菌种鉴定：
采用基因芯片试剂盒(北京博奥生物有限公司)进行菌种鉴定，具体操作流程参照文献[7]，超出鉴定范围菌种采用16S rDNA基因序列分析(由北京博奥生物有限公司送检)。
3．药物敏感试验：
采用WHO推荐的比例法(L-J固体培养法)进行9种抗结核药利福平(RFP 40 mg/L)、异烟肼(INH 0.2 mg/L)、链霉素(Sm 4 mg/L)、乙胺丁醇(EMB 2 mg/L)、阿米卡星(Am 40 mg/L)、卷曲霉素(Cm 40 mg/L)、氧氟沙星(Ofx 2 mg/L)、卡拉霉素(Km 30 mg/L)、克拉霉素(Clr 8 mg/L)的耐药性测试，由中国CDC国家参比实验室提供人型H37Rv标准菌株进行质量控制。耐药率＝耐药菌株/总菌株数×100%。
三、NTM病的诊断和治疗
参照2012年《非结核分枝杆菌病诊断与治疗专家共识》[8]进行。
四、统计学分析
采用SPSS 16.0统计软件进行数据整理，组间率的比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
结果
一、一般资料
2014年1月至2015年12月共收集12 460例患者，分离出阳性菌株3 991株(阳性率32.0%)。菌种鉴定结果NTM 125株，其中来源痰液112株、纤支镜冲洗液8株、尿液2株、脓分泌物1株、脑脊液1株、腹水1株。患者中男81例，女44例，年龄12～86岁，平均(50.3±18.1)岁，其中12～45岁53例、46～60岁29例、>60岁43例。
二、NTM菌种分布和耐药情况分析
125株NTM进行种或复合群鉴定，种群分布有9种，其中胞内分枝杆菌(37/125，29.6%)、鸟分枝杆菌(29/125，23.2%)、龟/脓肿分枝杆菌(42/125，33.6%)分离率较高，其次为偶然分枝杆菌(7/125，5.6%)和堪萨斯分枝杆菌(6/125，4.8%)，戈登分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌和猿分枝杆菌各分离1株，两年间NTM种群排位顺位无明显变化。125株NTM药物敏感试验显示，9种NTM对9种抗结核药物呈现不同程度耐药，平均耐药程度从高到低依次为INH最高，其次为RFP、Sm、OX、Am、Cm、EMB、Km和Clr 。不同NTM菌种中鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、龟/脓肿分枝杆菌对Sm、INH、RFP、OX和Am呈现高度耐药。见表1。125株NTM中有21株(16.8%)对9种药全部耐药，有117株(93.6%)对INH和RFP同时耐药，有78株(62.4%)耐4种以上药，两年间耐药率比较差异无统计学意义(χ2＝3.88，P>0.05)。
三、NTM与临床相关性研究
菌种鉴定后的125株NTM，其中87株进行了回顾性临床相关性分析，其余38株或因外院或区县送检标本病历资料不全未纳入分析。87例NTM感染者中男58例，女29例，中位年龄49.0岁。58例(58/87，66.7%)可能真正感染NTM并致病，其余29例因诊断依据不足、临床治疗效果不佳或死亡未纳入分析范围。58例患者中胞内分枝杆菌(20/58，34.5%)、龟/脓肿分枝杆菌(20/58，34.5%)、鸟分枝杆菌(15/58，25.9%)分离率较高，堪萨斯分枝杆菌较少(3/58，5.2%)。58株菌对INH、RFP和Sm呈现高度耐药，对Clr的耐药率最低(26/58，44.8%)。58株菌中55株来自呼吸道(痰液50株、纤维支气管镜检冲洗液5株)，2株来自泌尿系统，1株脓分泌物。43例患者抗酸染色阳性，15例阴性；34例多次NTM培养阳性，24例单次NTM培养阳性；均有不同程度咳嗽咳痰、发热等临床症状；胸部X线表现有不同程度肺部指征，27例有空洞形成；10例合并HIV感染，4例合并糖尿病和高血压，9例合并肺气肿，3例合并HBV感染，4例心脏病和2例NTM复治患者。2例患者死亡。10例HIV合并NTM感染者的标本均来自呼吸道，部分病例呈现多部位播散性感染，病情较重，胸部X线片表现多样化，空洞型改变比例相对较高。
讨论
NTM是一群能引起人体广泛疾病的分枝杆菌，临床表现从轻微的自限性皮肤感染到危及生命的全身感染[9]。近年来，NTM的感染病例和从实验室的分离率逐年增多[10,11,12]。由于地区差异，NTM分离率也存在一定的地域性，本研究结果显示，NTM感染以中老年为主，男性多于女性。2014年1月至2015年12月NTM的分离率呈现上升趋势，与国内NTM的发病趋势一致，低于2010年全国流调平均水平(22.9 %)[13]，高于2015年江苏地区的2.35%[11]和2012年沈阳地区的1.87%[12]，与Shao等[10]的研究(3.37%)较为接近，呈现明显的地域差异。李定越等[14]从2002年至2011年四川省2 356例阳性菌株中发现NTM分离率为10.65 %，与本研究有所差异，可能是研究人群和年限跨度不同的原因，也可能是与本实验室的分离条件不同有关。
由于NTM菌种繁多，对多种抗结核药天然耐药，本研究125株NTM比例法药物敏感试验显示对大多数抗结核药耐药，对INF和RFP的耐药率高达99.2%和97.6% ，对INF和RFP同时耐药的菌株达到117株，对EMB和Km耐药率相对较低，分别为65.6%和58.4% 。NTM临床诊疗指南指出Clr是近20年来治疗NTM最重要的新药，在本研究中Clr显示其耐药率最低(44.8%)，这也预示Clr有可能成为NTM治疗过程中重要的抗菌药物。NTM耐药是一个非常严峻的问题，同时不同NTM生长情况和耐药谱不同，反映NTM真实耐药性的体外药物敏感试验也有待提升，这也是目前NTM治疗效果不佳的原因。
鸟-胞内分枝杆菌复合群(M.avium complex, MAC)包括鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、副结核分枝杆菌和鼠麻风分枝杆菌等，MAC在人体内定植后可引起多种疾病，肺部感染最为常见。龟-脓肿分枝杆菌群包括3个种，即龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌和致免疫分枝杆菌，常可引起各种感染，包括肺、皮肤等。国内外研究发现，NTM现有种群分布中MAC和龟/脓肿分枝杆菌是引起NTM肺病的主要菌种[5,10]。2015年Shao等[10]从60株NTM中分离出41株MAC和6株龟/脓肿分枝杆菌。同样在本研究中分离的125例NTM也是以MAC(65/125, 52.0 %)和龟/脓肿分枝杆菌(43/125, 34.4%)为主，MAC当中又以胞内分枝杆菌较为常见，说明在本地区MAC和龟/脓肿分枝杆菌也是导致人类疾病的主要致病菌种。125株NTM菌种分布中也出现一小部分不常见的NTM (耻垢分枝杆菌、戈登分枝杆菌等)，它们引起人类感染的报道较少，常作为一类非致病性环境分枝杆菌污染水源，医疗器械等。
本研究对125例NTM患者进行回顾性临床相关性分析，87例患者最后纳入综合分析，尽管在治疗周期和随访观察方面有待进一步持续跟进，综合分析结果显示有58例患者可能真正感染NTM并致病，58例可疑NTM菌株中MAC和龟/脓肿分枝杆菌作为主要致病菌种的格局仍然未变，另外有3例堪萨斯分枝杆菌引起的NTM肺病，有报道堪萨斯分枝杆菌与人类疾病相关[15] ，该菌最易侵犯的部位是肺，常侵犯晚期艾滋病患者，在本研究分离的3例堪萨斯分枝杆菌感染的患者中有2例即合并HIV感染。本研究中有2例患者死亡，均为老年，这可能是患者在合并多种基础疾病的同时抗NTM治疗不佳最终死亡的原因。在本次研究中58例可能真正感染NTM并致病的临床病例中10例合并HIV感染，其中MAC 6例、龟/脓肿分枝杆菌2例、堪萨斯分枝杆菌2例，10例HIV合并NTM感染者的标本均来自呼吸道，其呼吸道症状较明显，部分病例呈现多部位播散性NTM感染，累及腹腔、心包等部位，病情较重，胸部X片表现多样化，空洞型改变比例也相对较高，这可能是艾滋病患者在免疫功能低下的情况下，更易合并NTM感染的原因，结果提示MAC、龟/脓肿分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌是合并HIV感染的常见菌种。
综上所述，2014年1月至2015年12月NTM在四川的发病率呈上升趋势，对多种抗结核药耐药，NTM菌种分布和与人类疾病相关性方面以MAC和龟/脓肿分枝杆菌为主。虽然本次抽样进行NTM与临床相关性分析的患者数较少，同时在代表性和典型性方面有一定的局限性，但对本地区在防治和治疗NTM疾病方面也是有所裨益。
中国微生物查询网（www.biobw.org）转载于《中华传染病杂志》2016年第9期