微生物分离之双层平板法的应用场景及操作要点有哪些？
小杨 / 2026-03-17 10:18:15
百欧博伟生物：双层平板法因能形成边界清晰、形态规则的空斑/溶菌圈，且能实现目标微生物与宿主的充分接触，是微生物学中兼具分离、计数、鉴定的经典方法，核心适配噬菌体相关研究，也广泛用于产溶菌活性微生物的筛选，同时可拓展至部分微生物的活性检测与特性鉴定，以下是其标准化、高频的应用场景，按研究方向分类说明，附实操要点：
一、噬菌体相关研究（核心主流应用）
这是双层平板法最经典、最核心的应用领域，也是该方法被研发的初衷，适配所有烈性噬菌体的相关实验，结果精准度远高于单层平板法，是噬菌体研究的金标准方法。
1、环境中噬菌体的分离与纯化
实操要点：样品需预处理（离心/浸提去杂质），宿主菌处于对数生长期，保证噬菌斑清晰可挑取。
2、噬菌体效价（滴度）的精准测定
测定样品中噬菌体的浓度，以PFU/mL（噬菌斑形成单位/毫升） 表示，是噬菌体增殖、保存、应用的基础定量指标。
计算公式：效价 = 单个平板噬菌斑数 × 稀释倍数 × 10（加入样品体积为 0.1mL 时），需选择噬菌斑数在30~300 个的平板统计，保证结果准确性。
3、噬菌体宿主范围的鉴定
更换不同的指示菌（宿主菌），将同一噬菌体样品铺于含不同宿主菌的双层平板，观察是否形成噬菌斑，判断噬菌体的宿主特异性（窄谱/广谱），为噬菌体的应用提供依据。
实操要点：所有指示菌均需活化至对数生长期，培养基适配对应宿主菌生长。
4、噬菌体的纯化与复筛
初筛得到的噬菌体常含杂噬菌/杂质，通过3~5 次连续的双层平板铺板 - 挑斑 - 增殖，获得形态、大小、活性均一致的纯噬菌体株，保证后续研究的单一性。
5、噬菌体增殖效果的检测
噬菌体在宿主菌悬液中增殖后，通过双层平板法测定增殖前后的效价，计算增殖倍数，判断噬菌体的增殖能力，筛选增殖效率高的噬菌体株。
二、产溶菌活性微生物的筛选与鉴定
利用双层平板法的溶菌圈效应，筛选能分泌溶菌酶、抗菌肽、抑菌蛋白等溶菌物质的微生物，通过溶菌圈的大小判断溶菌活性强弱，是微生物抑菌活性筛选的常用方法，适配细菌、真菌等微生物的初筛。
1、产溶菌酶微生物的筛选
从土壤、植物体表、动物肠道、发酵食品等样品中筛选芽孢杆菌、乳酸菌、放线菌等产溶菌酶的菌株，将样品稀释液铺于含指示菌（如
金黄色葡萄球菌）的双层平板，培养后观察溶菌圈，圈越大则溶菌酶活性越强。
2、益生菌抑菌活性的初筛
筛选具有抑菌作用的益生菌（如
乳酸菌、
双歧杆菌），将益生菌菌悬液/发酵上清铺于含致病菌（如
大肠杆菌、
沙门氏菌、
志贺氏菌）的双层平板，通过溶菌圈判断益生菌的抑菌效果，为益生菌的筛选提供快速依据。
3、海洋/极端环境微生物的抑菌活性筛选
海洋、高盐、高温等极端环境的微生物常产生特殊的溶菌物质，双层平板法可快速初筛这类微生物的溶菌活性，操作简便、结果直观，适合大规模样品的初筛。
4、溶菌物质活性的定量初步判断
将溶菌物质（如溶菌酶粗提液、抑菌蛋白纯化液）进行梯度稀释，铺于双层平板，通过溶菌圈的大小/有无，判断溶菌物质的最低抑菌浓度（MIC），为后续纯化提供参考。
三、其他拓展应用
除上述核心场景外，双层平板法还可根据空斑/圈形成原理，拓展至部分微生物的活性检测、突变株筛选等，是方法的灵活延伸，需结合实验需求调整条件。
1、病毒（非噬菌体）的分离与计数
部分动物/植物病毒可在宿主细胞（贴壁/悬浮细胞）中增殖，将含病毒的样品与宿主细胞混合铺于双层细胞平板（底层为固体培养基，上层为软琼脂 + 宿主细胞），培养后形成病毒空斑，用于病毒的分离、计数（空斑形成单位 PFU），如脊髓灰质炎病毒、腺病毒的检测。
注意：需适配动物/植物细胞的培养条件（如恒温 CO₂培养箱），培养基为细胞专用培养基。
2、微生物突变株的筛选
筛选对溶菌物质、噬菌体敏感/抗性的微生物突变株，将诱变后的微生物菌悬液铺于含噬菌体/溶菌物质的双层平板，通过无噬菌斑/无溶菌圈的菌落，筛选抗性突变株；反之可筛选敏感突变株。
3、溶菌物质的粗提液活性检测
对微生物分泌的溶菌物质进行粗提后，将粗提液梯度稀释铺于双层平板，通过溶菌圈的大小判断粗提液的溶菌活性，为后续的纯化工艺优化提供依据。
4、食品中抑菌微生物的快速检测
从酸奶、泡菜、酱油等发酵食品中快速筛选具有抑菌作用的微生物，双层平板法操作简便、耗时短（12~24h 出结果），适合食品微生物的快速检测与筛选。
四、不同应用场景的共性操作要点
无论用于噬菌体研究还是溶菌微生物筛选，双层平板法的核心操作要求一致，保证结果的准确性和重复性：
指示菌（宿主菌/靶菌）需活化至对数生长期，活性最强，空斑/溶菌圈最清晰；
上层软琼脂温度严格控制在45~50℃，避免高温杀死指示菌/噬菌体，低温导致软琼脂凝固；
样品稀释度需合适，保证平板上的空斑/溶菌圈数在30~300 个，避免过密（融合）或过疏（统计误差大）；
全程严格无菌操作，避免杂菌污染导致菌苔混乱，无法识别空斑/溶菌圈；
平板倒置培养，防止冷凝水滴落冲散上层软琼脂，干扰结果观察。
北京百欧博伟生物技术有限公司拥有Biolog微生物鉴定系统，超低温冰箱，生物安全柜等仪器设备可进行对微生物分离、鉴定等常规的分子实验研究。对我国生命科学研究、生物技术创新和产业发展的需求进行积极的面对社会乃至国外收集保藏提供微生物菌种资源。在保证生物安全和保护知识产权的前提下，为工农业生产、卫生健康、环境保护、科研教育提供微生物物种资源、基因资源、信息资源和专业技术服务。
除此之外，我们还拥有对菌种、细胞、培养基、配套试剂等产品需求者的极优质服务，对购买项目的前期资料提供,中期合同保证,后期货物跟踪到最终售后的确保项目准确到位，都有相关人士进行维护,确保您在
微生物菌种查询网中获得最优质服务！也正因为此，北京百欧博伟生物技术有限公司与国内外多家研制单位、生物制药、第三方检测机构和科研院所院校、化工企业有着良好、长期和稳定的合作关系！
下载附件
上一篇：乳糖蛋白胨半固体培养基的实验原理与现象及结果判断！