微生物实验室质控标准菌株的保存方法与适用场景及质控要点！
小杨 / 2026-02-10 10:57:08
百欧博伟生物：微生物实验室质控标准菌株的保存核心目标是维持菌株的遗传特性稳定、保持活性、防止污染与变异，需根据保存周期（短期、中期、长期）选择适配方法，同时严格遵循无菌操作与溯源管理规范。以下是不同保存方法的详细操作、适用场景及质量控制要点。
一、保存前的准备工作
1、菌株预处理
待保存菌株需为纯化后的对数生长期菌悬液，此时菌株代谢活跃、抗性强，保存后复苏率高。
对菌株进行最终鉴定（形态学 + 生化/分子生物学），确认无杂菌污染、特性与标准菌株一致。
用无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2）洗涤菌体 2~3 次，去除培养基残留，避免代谢产物对菌株的损伤。
2、耗材与试剂准备
耗材：无菌试管、冻存管、安瓿瓶（冻干用）、移液管，需经 121℃高压灭菌 20min 或一次性无菌耗材。
试剂：适配培养基（斜面用）、甘油（分析纯，配制成 50% 无菌甘油溶液）、冻干保护剂。
仪器：超净工作台、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌器、-20℃/-70℃冰箱、液氮罐（长期冻存用）。
二、不同保存方法的操作规范
（一）短期保存法（1~3 个月，日常质控用）
1、斜面保藏法
适用场景：实验室日常质控的工作菌株，如培养基适用性检查、人员操作考核的菌株。
操作步骤
制备适宜的固体培养基斜面（如细菌用营养琼脂 NA、真菌用马铃薯葡萄糖琼脂 PDA），灭菌后摆成斜面，冷却备用。
用无菌接种环挑取纯化的单菌落，划线接种于斜面培养基上（从斜面底部划至顶端，避免交叉）。
置于菌株最适温度培养至斜面长满菌苔（细菌 35±2℃培养 16~24h，真菌 25±2℃培养 48~72h）。
培养完成后，在斜面试管口塞上无菌橡胶塞，外包一层无菌牛皮纸，标注菌株名称、编号、传代次数、接种日期、有效期。
置于4℃冰箱避光保存。
关键要点
斜面菌苔不宜过厚，否则易因氧气不足导致菌株老化。
每月需复苏 1 次，重新接种新斜面，传代次数不超过 5 代。
2、半固体穿刺保藏法
适用场景：需氧菌、兼性厌氧菌的短期保存，尤其适合运动性细菌（如
变形杆菌）。操作步骤
制备半固体培养基（在液体培养基中加入 0.5%~0.8% 琼脂），分装试管，灭菌后冷却成半固体柱状。
用无菌接种针挑取单菌落，垂直穿刺至培养基底部，再沿原路拔出。
培养至培养基表面长出菌苔，密封试管后 4℃保存，保存期限 2~3 个月。
（二）中期保存法（6~12 个月，实验室常用储备菌株）
甘油冻存法
适用场景：细菌、酵母等菌株的中期保存，操作简便，复苏率高，是实验室最常用的方法。
操作步骤
制备20%~30% 无菌甘油溶液：甘油与无菌生理盐水按 1:1 或 1:2 体积混合，高压灭菌（121℃，20min），冷却后备用。
取对数生长期的菌悬液，与甘油溶液等体积混合，使终甘油浓度为 10%~15%（甘油浓度过高会损伤菌体）。
分装至无菌冻存管，每管 1~2mL，标注菌株信息。
冻存管先置于-20℃冰箱预冻 2~4h，再转移至-70℃超低温冰箱保存；若直接放入 - 70℃，需采用梯度降温（如 - 20℃→-40℃→-70℃，每步 2h），避免冰晶损伤菌体。
关键要点
甘油需提前灭菌，避免杂菌污染；冻存管需密封良好，防止甘油挥发和污染。
真菌菌株可适当提高甘油浓度至 15%~20%，保存前需去除菌丝体，保留孢子悬液。
（三）长期保存法（5~10 年，标准菌株的核心储备）
1、冻干保藏法（冷冻干燥法）
适用场景：国家级菌种保藏中心或实验室核心标准菌株的长期保存，可最大程度维持菌株遗传稳定性，是国际公认的金标准方法。
操作步骤
制备保护剂：常用 10% 脱脂牛奶溶液，灭菌后备用（保护剂可减少冻干过程中菌体的损伤）。
将对数生长期的菌悬液与脱脂牛奶保护剂按 1:1 体积混合，制成菌悬液（浓度≥10⁸ CFU/mL）。
分装至无菌安瓿瓶，每瓶 0.2~0.5mL，避免瓶壁残留液体。
预冻：将安瓿瓶置于 - 40℃冰箱预冻 2~4h，使菌悬液完全冻结。
冻干：将预冻的安瓿瓶放入冷冻干燥机，在真空条件下干燥 12~24h，至瓶内无冰晶、呈疏松粉末状。
密封：在真空状态下火焰熔封安瓿瓶，标注详细信息，置于 4℃冰箱避光保存。
关键要点
冻干后的菌株需进行复苏验证，复苏率≥80% 方可投入使用。
安瓿瓶需严格密封，防止吸潮导致菌株失活。
2、液氮保藏法
适用场景：对温度敏感的菌株或需要超长期保存的珍贵菌株，保存期限可达 10 年以上。
操作步骤
制备含 10% 甘油 + 5% 二甲亚砜（DMSO）的复合保护剂，过滤除菌。
菌悬液与保护剂按 1:1 混合，分装至液氮冻存管，标注信息。
梯度降温：4℃ 30min→-20℃ 1h→-80℃ 2h→投入液氮罐（-196℃）保存。
关键要点
液氮罐需定期补充液氮，确保液位稳定；冻存管需使用耐低温材质。
复苏时需快速将冻存管投入 37~40℃水浴中融化（1~2min 内完成），避免冰晶再次形成损伤菌体。
三、保存过程的质量控制要点
1、溯源管理
建立菌株保存台账，记录菌株名称、编号、来源、传代次数、保存方法、制备日期、有效期、复苏验证结果。
不同种属的菌株分开保存，避免交叉污染；致病性质控菌株（如
沙门氏菌、
志贺氏菌）需单独存放，遵循生物安全等级要求。
2、稳定性监测
短期保存的斜面菌株：每月复苏 1 次，检查菌落形态、染色特性及生化反应，确认无变异。
中期/长期保存菌株：每 6~12 个月复苏 1 次，进行全面鉴定，若特性变异则立即淘汰，重新从原始标准菌株复苏。
3、污染防控
所有操作在超净工作台内进行，耗材、试剂需严格灭菌；保存环境需定期清洁消毒。
每批次保存菌株需设置空白对照（未接种的培养基/保护剂同步保存），复苏时检查对照是否有杂菌生长。
4、安全管理
废弃的菌株培养物、冻存管需经高压灭菌后处理，防止生物危害。
四、常见问题及解决方案
常见问题 原因分析 解决方案
菌株复苏失败 冻存时未达对数生长期；甘油浓度过高；梯度降温不规范 确保菌株处于对数期；调整甘油浓度至 10%~15%；严格执行梯度降温程序
保存过程中污染 耗材灭菌不彻底；操作时无菌控制不足 加强耗材灭菌验证；严格无菌操作；设置空白对照
菌株特性变异 传代次数超过 5 代；保存温度波动过大 控制传代次数≤5 代；稳定保存温度（如 - 70℃冰箱避免频繁开关）
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