奶酪中常见微生物的分离方法与培养条件及质量控制！
小杨 / 2025-12-04 10:30:36
一、基于培养基选择性的分离方法（最常用）
1、乳酸菌分离（奶酪中优势菌，包括乳酸球菌、乳酸杆菌）
核心原理：利用乳酸菌耐酸、发酵乳糖产酸的特性，通过选择性培养基抑制杂菌（如革兰氏阴性菌、真菌）生长。
培养基选择：
MRS 培养基（分离乳酸杆菌）：含牛肉膏、蛋白胨、乳糖，添加乙酸钠（抑制真菌和革兰氏阴性菌）、吐温 80（促进乳酸菌生长），pH 6.2-6.4；
M17 培养基（分离乳酸球菌）：含 β- 甘油磷酸二钠（缓冲 pH）、乳糖，适合乳球菌（如乳酸乳球菌）生长，抑制乳杆菌；
选择性改良：若需分离耐盐乳酸菌，可添加 2%-4% NaCl；若需排除酵母菌，添加 0.01% 氯霉素。
操作步骤：
取梯度稀释后的奶酪菌悬液（10⁻⁴~10⁻⁶）0.1 mL，涂布于 MRS/M17 平板；
厌氧培养（80% N₂+10% CO₂+10% H₂），30-37℃培养 48-72 h；
挑取圆形、乳白色、边缘整齐的菌落，划线纯化 2-3 代，获得纯菌株。
2、霉菌/酵母分离
核心原理：利用真菌耐酸、耐放线菌酮的特性，抑制细菌生长。
培养基选择：
PDA 培养基（马铃薯葡萄糖琼脂）：基础真菌培养基，添加 0.1% 氯霉素/链霉素（抑制细菌）、0.05% 放线菌酮（抑制部分霉菌杂菌）；
YPD 培养基（分离酵母）：含酵母粉、蛋白胨、葡萄糖，pH 5.6，添加氯霉素抑制细菌；
选择性改良：分离耐盐酵母可添加 5%-10% NaCl；分离产蛋白酶霉菌可添加酪蛋白作为唯一氮源。
操作步骤：
取 10⁻²~10⁻⁴稀释液 0.1 mL 涂布平板，25-28℃有氧培养（霉菌 5-7 d，酵母 2-3 d）；
霉菌挑取带特征菌丝/孢子的菌落（如青霉呈蓝绿色、毛霉呈白色棉絮状），酵母挑取乳白色、湿润的菌落；
霉菌用插片法纯化，酵母用划线法纯化，直至菌落形态均一。
（1）李斯特菌
培养基：PALCAM 琼脂（抑制革兰氏阴性菌和部分革兰氏阳性菌）、牛津琼脂；
操作：取 10⁻¹~10⁻³ 稀释液涂布，37℃需氧/微需氧培养 24-48 h，挑取黑色、周围有晕圈的菌落纯化。
（2）金黄色葡萄球菌
培养基：Baird-Parker 琼脂（含卵黄、亚碲酸钾，葡萄球菌还原亚碲酸钾形成黑色菌落）；
操作：添加 7.5% NaCl 的肉汤预增菌（抑制杂菌），37℃培养 18 h 后涂布平板，挑取黑色、有光泽的菌落纯化。
二、基于培养条件的分离方法（辅助筛选）
1、厌氧/微需氧分离法
适用菌：乳酸菌、双歧杆菌（奶酪中部分益生菌）；
方法：
厌氧罐/厌氧工作站培养：使用厌氧产气袋（生成 H₂+CO₂，钯催化剂还原 O₂），严格厌氧环境；
微需氧分离：5%-10% CO₂环境（如 CO₂培养箱），适合弯曲菌等微需氧菌（奶酪中偶见污染菌）。
2、温度选择性分离法
原理：利用不同微生物最适生长温度差异筛选；
应用：
低温培养（10-15℃）：分离奶酪中低温耐受的酵母/霉菌（如
假丝酵母）；
3、渗透压选择性分离法
原理：奶酪高盐环境，耐盐菌可在高渗培养基中生长；
应用：分离耐盐葡萄球菌、盐耐受酵母时，在培养基中添加 5%-15% NaCl，抑制不耐盐微生物。
三、特殊分离方法（针对难培养/微量菌）
1、预增菌分离法
适用场景：奶酪中目标菌含量极低、受杂菌抑制；
方法：先将稀释液接种至液体选择性培养基（如
李斯特菌的 FB1 增菌液、
葡萄球菌的 7.5% NaCl 肉汤），37℃培养 18-24 h，使目标菌增殖后再涂布平板分离，提高检出率。
2、梯度稀释涂布 + 平板划线结合法
核心步骤：
梯度稀释后涂布，获得单菌落密集度适中的平板；
用无菌接种环挑取单个菌落，在新鲜选择性培养基上连续划线（至少 3 次），每次划线仅挑取前一次划线末端的菌落，直至菌落形态、镜检特征完全一致，确保纯培养。
3、显微操作分离法（精准分离）
适用场景：需分离特定形态的微生物（如奶酪中与脂肪球结合的乳酸菌）；
方法：在显微镜下用显微操作针挑取单个细胞/孢子，接种至微滴培养基中培养，适合稀有菌或难分离菌，但操作要求高、耗时。
四、分离过程的质量控制
空白对照：每批次实验设置培养基空白（仅培养基，无样品），若有菌落生长，说明培养基/操作污染，实验无效；
纯度验证：分离后的菌株需镜检（革兰氏染色、孢子形态观察）+ 生化鉴定（如乳酸菌发酵糖类、葡萄球菌凝固酶试验），确认无杂菌；
培养时间：避免培养过久导致菌落重叠（乳酸菌≤72 h，霉菌≤7 d），影响分离准确性。
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