植原体菌种保藏技术规程的原理与方法及要求有哪些？
小杨 / 2025-10-30 09:14:37
百欧博伟生物：植原体菌种保藏技术规程主要包括保藏原理、保藏方法、技术要求等方面，以下是详细介绍：
一、范围
规定了植原体菌种保藏的基本原则、方法及技术要求，适用于各类植原体菌种的保藏。
二、术语与定义
植原体是指寄生于植物韧皮部和介体昆虫体内的、具有三层单位膜结构的无细胞壁的原核生物，一般引起植物叶片黄化和发育畸形等症状。
三、原理
植原体菌种尚不能在离体人工培养基上培养，通过对感染植原体的植物茎段进行繁殖，即可达到对植原体的繁殖和培养。较低的温度条件可减缓植物和植原体的代谢活动，减少菌株突变，降低繁殖速度，有效保持菌种原有性状。
四、技术要求
1、保藏方法：
用组织培养法保藏感染植原体的植物组织，于 5-25℃温度范围内保藏。
2、植物组织培养基：
选用适于植物组织正常生长的培养基，不含四环素簇抗生素或其它对植原体生长和繁殖有抑制作用的成分。
3、培养温度和光照：
培养温度 20-28℃为宜，光照强度在 1000-3000lx，光期为 10-14h/d。
4、保藏温度和时间：
常温保藏（20-28℃），保藏时间 1-3 个月；低温保藏（6-10℃），保藏时间 6 个月至 1 年。
5、保藏期检测：
定期检查保藏菌种的房间、冷库、冰箱的温度、湿度，检查各保藏试管有无杂菌污染现象，如发现杂菌污染，则取出该管重新移植，培养后补缺。
6、移植复核：
大量植原体 - 植物共生体进行移植时，各菌株的编号、所用培养基需仔细核对无误。每次移植培养后，对照原保藏的菌株和菌种顺序号卡片名录，核实无误再行存放。
7、保藏指标：
当获得的组培苗表现典型症状或在荧光显微镜下观察到特异植原体 DNA 荧光后即可进行菌株的保藏。
五、操作方法与步骤
1、带菌外植体采集：
在田间采集表现典型症状的新鲜枝条，剪去叶和嫩梢，经酒精和升汞等消毒剂表面消毒后，截成具节茎段，移入培养基上培养。
2、无杂菌组培苗的获得：
外植体长出新枝后，选无杂菌感染的外植体，截取新枝，移入新配制的培养基上培养和繁殖。如培养基被杂菌污染，将组培苗再进行表面消毒处理，移入新的培养基上培养，重复操作 2-3 次，直至获得无杂菌组培苗为止。
3、组织带菌鉴定：
用 DAPI 荧光显微镜技术和 PCR 技术鉴定组织带菌状况和浓度。
4、常温保藏：
植原体 - 植物共生体在适宜的组织培养基上培养，并在正常温度和光照下（20-28℃，光照强度在 1000-3000lx）进行保藏，保藏周期为 1-3 个月。
5、低温保藏：
将正常温度和光照下（20-28℃，光照强度在 1000-3000lx）培养的植原体 - 植物共生体移入含组织培养基的试管内，移入 6-10℃低温冷藏柜内保藏，1-2 个月将试管暴露于正常培养温度和光照条件下补光 2-3 天，然后存放于低温冷藏柜继续保藏，保藏周期为 6 个月至 1 年以上。
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