酵母基因组DNA提取试剂盒的纯度检测与操作方法！
小杨 / 2024-04-16 08:54:24

 

一、背景
 
酵母基因组DNA提取试剂盒采用DNA吸附柱和独有的溶液系统，适合于从多种来源的酵母培养物中快速简单地提取基因组DNA。约3ml处于指数生长期的酵母培养液一般一次抽提可纯化出10-15μg的高质量的基因组DNA。纯化DNA产物可直接用于PCR、酶切和杂交等实验。
 
酵母细胞经lyticase处理去除细胞壁后，独特的结合液/蛋白酶K迅速裂解细胞和灭活细胞内核酸酶，然后基因组DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤，抑制物去除液和漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组DNA从硅基质膜上洗脱。
 
二、原理
 
采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞并结合破壁酶特异消化酵母细胞壁，能在1小时内从酵母培养液中分离出高纯度质粒DNA。酵母收集后,加入破壁酶去除细胞壁后,然后碱裂法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低PH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐、高PH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
 
三、产品特点
 
1、离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
 
2、不需要使用有毒的苯酚等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。
 
3、快速，简捷，单个样品裂解后操作一般可在30分钟内完成。
 
4、多次柱漂洗确保高纯度，OD260/OD280典型的比值达1.7～1.9，可直接用于PCR，Southern-blot和各种酶切反应。
 
四、操作方法
 
酵母细胞经lyticase处理去除细胞壁后，独特的结合液/蛋白酶K迅速裂解细胞和灭活细胞内核酸酶，然后基因组DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤，抑制物去除液和漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组DNA从硅基质膜上洗脱。
 
五、保存条件
 
室温保存，12个月内有效。ProteinaseK与Lyticase-20℃保存。
 
六、纯度检测
 
基因组DNA片段的大小与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。提取的DNA片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。可配制0.8-1.0％琼脂糖凝胶，使用λ/HindIII判断基因组的大小，完整的基因组大小应在23kb以上。使用分光光度计检测时，OD260/OD280比值应为1.7–1.9之间，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水洗脱，比值可能偏低，但并不表明DNA纯度不高。
 
七、注意事项
 
1、样品应避免反复冻融，否则会导致提取的片段较小且提取量下降。
 
2、若试剂盒中的溶液出现沉淀，可在65度水浴中重新溶解后再使用，不影响提取效果。
 
3、洗脱缓冲液的体积好不少于50ul，体积过小会影响回收效率；洗脱液的值对洗脱效率也有影响，若需要用水做洗脱液应保证其pH值在8.0左右可用NaOH将水的pH值调至此范围值低于7.0会降低洗脱效率。DNA产物应保存在-20℃，以防降解。
 
八、应用
 
酵母基因组DNA提取试剂盒可用于酵母基因组DNA提取：
 
在光滑球拟酵母基因组规模生物模型的构建与应用研究中以丙酮酸工业生产菌株Candida glabrata CCTCC M202019为研究模型,在完成全基因组测序、基因组功能注释和比较基因组学研究的基础上,构建了基因组规模代谢网络模型(Genome-scale metabolic model,GSMM)、转录调控网络模型(Transcriptional regulatory network,TRN)和工业微生物辅因子代谢网络模型(Genome-scale cofactor metabolic model,GSCMM)。
 
结合上述基因组规模生物模型,运用基于约束的优化算法,从基因、代谢、转录、辅因子等层面上解析了C.glabrata的生理特征(如丙酮酸的高产、低致病性相关的生物安全性等),并发展了优化其生产性能(如丙酮酸、富马酸等丙酮酸去路中代谢物)的方法。
 
主要研究结果如下:1.运用二代高通量测序技术,对C.glabrata CCTCC M202019进行全基因组测序,其基因组特征包括:12.1 Mbp基因组大小、38.47%GC含量、5345个基因、191个t RNA、6个r RNA和1.15%的重复序列等。与C.glabrata CBS138进行比较基因组分析,发现虽然两菌基因组具有高度相似性,但也存在差异如:中心碳代谢(营养物质和二羧酸的转运、氧化磷酸化和丙酮酸分解代谢)和黏附性代谢(凝集素蛋白的低复杂度重复区和功能结构域的缺失和变化)。
 
在此基础上,借助在四种培养基上的丙酮酸发酵实验、哥伦比亚血平板上生长实验、96孔微孔板内壁和内皮细胞的黏附实验,证明了C.glabrata CCTCC M202019比CBS138菌株具有更强的丙酮酸生产能力和更弱的黏附性和细胞毒性。2.根据C.glabrata氨基酸序列、文献挖掘和专业数据库,构建了C.glabrata的GSMM i NX804。模型i NX804包括804个基因、1025个代谢物和1287个生化反应,分布于细胞质、线粒体、过氧化物酶体、高尔基体、液泡和胞外区间。
 
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