伊氏副球菌的菌株培养与注意事项及保存方法！
小杨 / 2024-03-15 09:09:31
伊氏副球菌是Paracoccus属的微生物，原产地为中国。菌体球形或近球形，单个、成对或成簇排列，革兰氏阴性。主要用途为研究，具体用途为发酵普洱茶。
一、菌种简介
规格：冻干物
拉丁属名：Paracoccus Yeei
拉丁名称：Paracoccus yeei
来源历史：←自行分离
收藏时间：2017-12-20
原始编号：G2-13
原产国：中国
资源归类编码：15131135102
模式菌株：非模式菌株
主要用途：研究
特征特性：菌体球形或近球形，单个、成对或成簇排列，革兰氏阴性。
具体用途：发酵普洱茶。
生物危害程度：四类
培养基编号：CM0847
培养基名称：胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）(CAIQ0701)
培养基成分：胰蛋白胨 15.0g，大豆胨 5.0g，氯化钠 5.0g，琼脂 13.0 g，蒸馏水 1.0L，pH7.3±0.2。推荐使用商品化成品培养基。
培养温度：28℃
需氧类型：好氧
分离基物：晒青毛茶
采集地：云南勐海
保存方法：-80℃冰箱冻结法；真空冷冻干燥法
共享方式：公益性共享；资源纯交易性共享；合作研究共享；资源交换性共享
提供形式：冻干物
用途：发酵普洱茶
注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用（产品信息以出库为准）
二、培养基
MRS 培养基
酪蛋白胨 10 克 牛肉浸取物 10 克
酵母提取液 5.0 克 葡萄糖 20 克
乙酸钠 5.0 克 柠檬酸二胺 2.0 克
吐温 80 1.0 克 磷酸氢二钾 2.0 克
七水硫酸镁 0.2 克 七水硫酸锰 0.05 克
碳酸钙 20.0 克 琼脂 20.0 克
蒸馏水 1.0 升 PH 6.8
如果要配制液体培养基，则不用加入碳酸钙和琼脂
三、保藏条件
斜面菌种和冻干菌种应在 2-8°C 保存。西林瓶请置于-20°C 保存。甘油请置于-80 度。
四、培养方法
1、菌种是指食用菌菌丝体及其生长基质组成的繁殖材料。菌种分为母种（一级种）、原种（二级种）和栽培种（三级种）三级。工业发酵的有用菌种，其筛选步骤包括菌种分离、初筛和复筛。
2、挑选具有某种能力的有用菌种，也称种子制备，是指菌种在一定条件下，经过扩大培养成为具有一定数量和质量的纯菌种的制备过程。以作接入发酵罐中进一步扩大菌体量及合成产物之用。
3、种子制备包括孢子制备和菌丝体制备菌种制备。
4、保存在沙土管或冷冻管中的菌种，用无菌手续挑取少许，接入琼脂斜面培养基上，在25℃（或较高温度）下培养5～7天（或较长时间。所得孢子还需进一步用较大表面积的固体培养基以获得更多孢子（对于霉菌类孢子制备，多数采用大米、小米之类的天然培养基）。
5、将培养成熟的斜面孢子制成悬浮液，接种到扁瓶固体培养基上，于25～28℃培养14天。将成熟的扁瓶孢子于真空中抽干，使水分降至10%以下，并放入 4℃冰箱中备用。一次制得的孢子瓶可在上延续使用半年左右。
6、如果有些菌种不产孢子，如赤霉素产生菌或产孢子不多的，则可采用摇瓶液体培养制得菌丝体，作种子罐的种子。种子罐的目的是使接入有限的孢子或菌丝体迅速发芽、生长、繁殖成大量菌体。其中的培养基组分应是易于被菌体利用的碳源（如葡萄糖）和氮源（如玉米浆），及无机盐(如磷酸盐)等。作为发酵罐的种子应生命力旺盛、染色深、菌丝粗壮，无杂菌及异常菌体。接种量一般在10%～20%。
五、注意事项
1) 首次活化，用尽量少的复水液溶解，接种在 5ml 的液体培养基中，静止培养，如有不明白之处，请务必先咨询我单位技术人员，避免不必要的损失；二次接种量要多，固体斜面培养基水分要少才能让菌体长得比较明显，液体培养要静止培养；
2) 经过冷冻干燥保藏，菌种处于休眠状态，复苏培养时可能会延迟生长，这时需较长的培养时间； 若您收到的是已复苏的培养物（非冻干菌），则可以直接用于您的实验，或根据需要转接培养如有不明白之处，请务必先咨询我单位技术人员，避免不必要的损失；
3）微生物菌种应保藏于低温、清洁干燥的地方，室温放置时间过长会导致菌种衰退；
4）菌种操作应在无菌条件下进行；转种完毕，应经灭菌再做丢弃处理；
5）应根据菌种状况及时转接，冻干菌种保藏时间通常为 2-25 年；
6）菌种使用过程中如出现杂菌污染或菌种生产性能下降，应及时和
微生物菌种查询网联系；
7）如若有菌种复苏不活或者污染等情况，请在收到菌种后 2 个月内联系，逾期不予受理；
8）打管操作需由专业微生物技术人员在相应的防护设备中进行，生物危害程度为三类的菌种应在生物安全柜中操作，打管时冻干管应远离面部，保护眼睛；
9）安瓿瓶开封：用浸过 75％酒精的脱脂棉擦净安瓿管，用火焰加热其顶端，滴少量（2-3滴）无菌水至加热顶端使之破裂，用锉刀或者镊子敲下已破裂的安瓿管顶端并将冻干管开口处在火焰上过一遍，并保持在火焰旁操作；
10）甘油管使用：使用本甘油菌时可以不用完全融解，在甘油菌表面蘸取少量涂板或进行液体培养即可。也可以完全融解后使用，但随着冻融次数的增加，细菌的活力会逐渐下降。
六、保存方法
1、传代保存法：培养基的浓度不宜过高，营养成分不宜过于丰富，尤其是碳水化合物的浓度应在可能的范围内尽量降低。培养温度通常以稍低于最适生长温度为好。若为产酸菌种，则应在培养基中添加少量碳酸钙。
2、液体石蜡覆盖保存法：该法较前一种方法保存菌种的时间更长，适用于霉菌、酵母菌、放线菌及需氧细菌等的保存。
3、悬液保存法：
①蒸馏水保存法：适用于霉菌、酵母菌及绝大部分放线菌，将其菌体悬浮于蒸馏水中即可在室温下保存数年。本法应注意避免水分的蒸发。
②糖液保存法：适用于酵母菌，如将其菌体悬浮于10%的蔗糖溶液中，然后于冷暗处保存，可长达10年。除此之外，也可使用缓冲液或食盐水等进行保存。
4、载体保存法：①土壤保存法；②砂土保存法；③硅胶保存法；④磁珠保存法；⑤麸皮保存法；⑥纸片(滤纸)保存法。
5、常用的冷冻保存法：
①低温冰箱保存法(-20℃、-50℃或-85℃)：低温冷冻保存时使用螺旋口试管较为方便，也可在棉塞试管外包裹塑料薄膜。保存时菌液加量不宜过多，有些可添加保护剂。此外，也可用φ5mm的玻璃珠来吸附菌液，然后把玻璃珠置于塑料容器内，再放入低温冰箱内进行保存的。
②干冰保存法(-70℃左右)：即将菌种管插入干冰内，再置于冰箱内进行冷冻保存。
③液氮保存法(-196℃)：是适用范围*的微生物保存法。
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