嗜水气单胞菌PCR试剂盒的应用及培养操作步骤!
小杨 / 2023-09-16 09:31:20


一、背景

嗜水气单胞菌PCR试剂盒适用于检测的扁桃体、淋巴结等组织病变部与健康部交界处组织、全血等标本中嗜水气单胞菌DNA,适用于嗜水气单胞菌感染的辅助诊断。

嗜水气单胞菌PCR试剂盒采用TaqMan探针法实时荧光PCR技术,通过设计一对嗜水气单胞菌特异性引物,结合一条特异性探针,用荧光PCR技术对嗜水气单胞菌的核酸进行体外扩增检测,用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。

二、嗜水气单胞菌PCR试剂盒操作步骤

(一)稀释标准曲线样品(以10E2-10E7拷贝/μL这6个10倍稀释度为例)。由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。

1、标记6个离心管,分别为7,6,5,4,3,2。

2、用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液,最好用带芯枪头,下同)。

3、在7号管中加入5μL阳性对照(浓度为1×10E8拷贝/μL,试剂盒提供),充分震荡1分钟,得1×10E7拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

4、换枪头,在6号管中加入5μL1×10E7拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1分钟,得1×10E6拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

5、换枪头,在5号管中加入5μL1×10E6拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1分钟,得1×10E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

6、重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

(二)样品DNA的制备

7、用自选方法纯化样品的DNA,本产品跟市场上绝大多数核酸纯化产品兼容。

8、如果有N个样品,则需要进行N+2个样品提取,多出的一个用作样品制备阳性对照管、另一个用作样品制备阴性对照管。

(三)设置qPCR反应(20μL体系,在样品制备室进行)

9、如果做定量分析并且只做1次重复,则标记N+9个PCR管,其中N+2个用于上步得到的N+2个样品,1个用于PCR阴性对照(用水做模板),6个用于标准曲线。如果做定性分析,并且只做1次重复,则标记N+4个PCR管,其中N+2个用于上步得到的N+2个样品,1个用于PCR阴性对照(用水做模板),1个用于PCR阳性对照(用第一步稀释得到的标准曲线系列稀释液的第4号做模板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

10、在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复):

(四)数据处理

11、如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的log值为横轴,以Ct值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值,再推算出其浓度。

12、如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct值应该小于或等于30。对待测样品,如果其Ct大于或等于40则为阴性,如果小于或等于35则为阳性。如果在35-40之间,则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性,如果小于40,则为阳性。

三、应用

嗜水气单胞菌PCR试剂盒可以用于嗜水气单胞菌感染后鲤Slc15基因表达研究:

在鲤(Cyprinus carpio)基因组中鉴定出10个Slc15基因家族成员,比较基因组学分析显示鲤Slc15基因显著扩增,并验证了鲤的第四轮全基因组复制(4R-WGD)。通过进一步系统发育关系分析,证实该基因家族在鲤进化过程中具有高度保守性。使用半定量RT-PCR法对鲤健康组织中的Slc15基因表达分析,发现大多数基因表达表现出组织特异性。

在负责消化吸收的鲤肠道中观察到Slc15基因具有相对较高的表达水平,表明Slc15基因在营养转运过程中起到关键作用。部分基因拷贝具有相似的表达模式,如Slc15a1b-1/-2、Slc15a2-1/-2和Slc15a4-1/-2,表明两个拷贝基因之间的功能可能没有发生大的分化。此外,还观察到部分拷贝基因之间的表达出现差异,例如Slc15a1a-1/Slc15a1a-2和Slc15a5-1/Slc15a5-2,这些差异反映基因复制后,不同拷贝之间的功能出现分化,该发现为鲤全基因组复制后基因的功能多样化提供了证据。

为了研究嗜水气单胞菌感染后鲤Slc15基因的蛋白表达模式,本研究首先制备鲤Slc15a1a、Slc15a1b、Slc15a2-1和Slc15a2-2基因的多克隆抗体,从蛋白质水平上探究了上述基因在鲤体内免疫应答机制中的变化。在对Slc15a1两个拷贝基因的研究中,采用ELISA法检测获得鼠抗Slc15a1a和Slc15a1b的效价分别为8.1×105和2.7×105。当受到嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)感染时,鲤Slc15a1a和Slc15a1b的最高蛋白表达水平与空白对照组相比,分别增加了3.39和2.85倍,说明本实验制备的多克隆抗体具有较高的亲和力和特异性,并表现出较强的免疫原性,能够及时诱导机体产生免疫应答。

Slc15a1a在嗜水气单胞菌感染后3 h和6 h迅速做出高表达量响应,在12 h后开始出现表达水平的下降,但Slc15a1b在3~24 h时却一直维持着较稳定的高表达响应,这说明Slc15a1a和Slc15a1b之间具有一定的表达差异。在感染过程中,Slc15a1a的表达量基本高于Slc15a1b。因此Slc15a1a可能是Slc15a1的主效基因,在鲤免疫应答过程中起到更加重要的作用。在对Slc15a2的研究中,也发现了相似的结果。

嗜水气单胞菌感染后,两个拷贝基因之间整体具有相似的表达趋势,说明二者之间可能具有相似的基因功能。Slc15a2-1虽在3 h时率先做出低表达响应,但与Slc15a2-1相比,Slc15a2-2在0 h至48 h之间显著高表达,可能是作为该基因拷贝中的主效基因,并且从6 h到24 h时,两个拷贝就一直呈现互补的表达方式,共同表达量维持在较高水平,在面对病原侵害时共同做出有效响应。

嗜水气单胞菌感染鲤后,实时荧光定量q RT-PCR结果显示:几乎所有的S lc15基因在感染早期都有表达增加的趋势,并在感染后12 h达到最高表达水平。在胁迫后的最后两个阶段,表达水平呈直线下降趋势,并在48 h达到最低表达水平。在感染早期,Slc15基因可以在炎症因子的刺激下积极上调表达水平,通过“放大”免疫信号,提高机体抵抗外来入侵的防御能力。因此,激活Slc15基因可能是一种治疗鲤嗜水气单胞菌感染病的有效方法。

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