一、背景
人BURKKIT淋巴瘤细胞是从一位16岁黑人男性Burkitt's淋巴瘤患者建立了Daudi细胞株。表面免疫球蛋白阳性(sIg+)。Β2-微球蛋白阴性，EBNA阳性，并有衣壳抗原VCA。细胞株携带EB病毒。Daudi是典型的B淋巴母细胞，广泛应用于白血病发生机理的研究。
二、人BURKKIT淋巴瘤细胞培养方法
1、人BURKKIT淋巴瘤细胞传代：细胞密度达到80-90%时即可传代
①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次；
②加入2ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆盖整个瓶或皿，盖好放入培养箱消化；
③1-2min后，显微镜下观察人BURKKIT淋巴瘤细胞，若大部分细胞回缩且有少量人BURKKIT淋巴瘤细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入完全培养基终止消化；若细胞还是贴壁，放回培养箱继续消化至可以轻轻吹打下为止；
④将人BURKKIT淋巴瘤细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清；
⑤用新鲜培养基重悬后加入培养瓶或皿中，T25培养瓶加6-8ml培养基；
⑥悬浮人BURKKIT淋巴瘤细胞直接离心收集，细胞沉淀重悬后分到新培养瓶中。
2、人BURKKIT淋巴瘤细胞复苏：
①将冻存管在37℃温水中快速摇晃融化，时间1min左右，加入4-5ml培养基混匀。
②在1000RPM左右条件下离心4min，弃上清,加1-2ml培养基吹匀，将人BURKKIT淋巴瘤细胞悬液加入培养瓶中，补加适量培养基。
3、人BURKKIT淋巴瘤细胞冻存：待细胞生长状态良好时进行细胞冻存保种
①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次，加入1mL 0.25%胰蛋白酶（T25瓶）
②1-2min后，显微镜下观察细胞，大部分人BURKKIT淋巴瘤细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入完全培养基终止消化；
③将人BURKKIT淋巴瘤细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清，加1ml冻存液重悬细胞；
④将冻存管放入程序降温盒，放入-80℃冰箱，4小时后将冻存管转入液氮罐储存。
三、应用
人BURKKIT淋巴瘤细胞可以用于HBV抗原HBx对弥漫性大B细胞淋巴瘤作用机制研究：
CXCR4(CXC chemokine receptor 4,CXCR4)是一种趋化因子受体,与其配体SDF-1结合,对淋巴细胞有很强的趋化作用。CXCR4可以介导浆细胞等淋巴细胞“归巢”到骨髓,而完成自我更新,并维持骨髓内微环境稳态。CXCR4也可允许淋巴细胞在组织及淋巴管中的运行。而这种允许功能,可使淋巴瘤在诊断时即存在远处转移或骨髓受累,而这种现象在DLBCL中也可被观察到。有研究表明CXCR4表达阳性是DLBCL的不良预后因素。因此,DLBCL合并HBV感染时,肿瘤细胞中是否存在CXCR4表达水平的改变,以及CXCR4是否可通过某种途径参与肿瘤的预后不良,是本课题要解决的问题。
研究方法：收集2012年至2019年,来自5个医疗中心组织(吉林大学第一医院,吉林大学中日友好医院,大连市第二医院,山西医科大学附属医院,吉林省人民医院)初次病理明确诊断为DLBCL的患者的样本及临床信息,其中96例HBsAg+DLBCL,10例HBsAg-DLBCL。10例HBsAg阳性HBV感染患者的肝组织作为阳性对照,10例无HBV感染淋巴结反应性增生患者的淋巴结组织作为阴性对照。通过IHC染色及改良IRS评分系统,明确血清HBsAg阳性DLBCL患者组织中是否可检测出HBV抗原(Pre-S1,Pre-S2,HBx,HBc)。
随后应用慢病毒转染方法,建立HBx稳定表达的DLBCL细胞系,通过流式细胞术,qRT-PCR,PCR验证目标基因的插入。通过CCK8,Annexin-V/7AAD,Transwell小室检测细胞体外增殖、凋亡、侵袭及转移功能。同时建立异种肿瘤小鼠模型、PET/CT等方法,在体内观察体肿瘤的增殖,同时应用IHC,骨髓涂片,及骨髓累及情况查看疾病进展。
最后,通过Western Blot,测定HBx稳定表达的SUDHL-4细胞CXCR4水平,及其下游的MEK/ERK、PI3K/AKT通路的磷酸化。明确CXCR4的作用通路,小干扰RNA实验进一步验证通路。完成HBx促进SUDHL-4细胞迁移机制的初步探索。
实验结果：
1、HBsAg+DLBCL组织中,应用免疫组织化学方法可检测到HBx及Pre-S2抗原表达。其中HBx表达与HBV阳性DLBCL的HBV高载量、Ann Arbor分期Ⅳ期、不良预后以及c-Myc高表达有关。而Pre-S2的表达在临床统计中未见显著性差异。
2、体外实验发现稳定表达HBx的可以促使SUDHL-4和U2932细胞系增殖、迁移,抑制凋亡,但不能影响细胞侵袭。体内实验也表明HBx表达增加可促进肿瘤增长,骨髓累及明显增多。
3、体内外实验发现在HBx稳定表达SUDHL-4组,CXCR4表达升高,并在体外发现CXCR4下游MEK/ERK通路被磷酸化激活。小干扰RNA敲低CXCR4时上述磷酸化现象消失,同时抑制细胞迁移,证明在HBx稳定表达的SUDHL-4,CXCR4可能是通过激活MEK/ERK通路影响细胞的生物学活性。
结论：
1、HBsAg+DLBCL患者肿瘤细胞中存在HBV抗原HBx及Pre-S2。
2、HBx表达的HBsAg+DLBCL患者临床预后差。
3、HBx可能是通过上调CXCR4并激活CXCR4/MEK/ERK磷酸化途径促进肿瘤迁移。
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