一、背景
大鼠胰岛细胞瘤细胞（INS-1细胞）源自X射线照射的移植胰岛瘤的大鼠，胰岛素阳性，可合成胰岛素原I和II，可用于beta细胞功能研究。INS-1(大鼠胰岛细胞瘤细胞)“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与细胞世代或倍增不同。在一代中，细胞培增3～6次。细胞传代后，一般经过三个阶段：游离期、指数增生期和停止期。常用细胞分裂指数表示细胞增殖的旺盛程度，即细胞群的分裂相数／100个细胞。一般细胞分裂指数介于0.2％～0.5％，肿瘤细胞可达3～5％。接种2～3天分裂增殖旺盛，是活力zui好时期，称指数增生期(对数生长期)，适宜进行各种试验。
二、细胞培养操作步骤
1、大鼠胰岛细胞瘤细胞培养基及培养冻存条件准备：
1）准备1640培养基；优质胎牛血清，10%；0.05mMβ－巯基乙醇；丙酮酸钠1%；双抗，1%。
2）大鼠胰岛细胞瘤细胞培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。
3）大鼠胰岛细胞瘤细胞冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。
2、大鼠胰岛细胞瘤细胞处理：
1）冻存大鼠胰岛细胞瘤细胞的复苏：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。
2）大鼠胰岛细胞瘤细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
对于贴壁细胞传代可以参考以下方法：
1、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2、加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53mMEDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。
3、轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。
3）大鼠胰岛细胞瘤细胞冻存：收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。
三、应用
大鼠胰岛细胞瘤细胞可以用于金丝桃素光动力学效应诱导RINm5F胰岛细胞瘤细胞凋亡及其机制研究：
将市售贯叶连翘提取物3kg经硅胶柱层析预处理,得到4.5g金丝桃素半成品,再用高速逆流色谱法进一步纯化精制,以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(3-5-3-5)为溶剂系统,下相为流动相,上相为固定相,主机转速800 r/min,流动相流速为2.5 ml/min,检测波长590 nm,每次进样量40 mg,共用12次完成了金丝桃素的大量制备,最终制得2g金丝桃素单体,经液相检测其纯度大于98%,应用1H-NMR和13C-NMR进行鉴定,证明确为金丝桃素。
胰岛细胞瘤会引发神经低血糖症状和永久性神经损伤,甚至会导致病人死亡。目前临床上使用的治疗方法,对于恶性胰岛细胞瘤和良性胰岛细胞瘤都没有令人满意的治疗效果。金丝桃素作为光动力学疗法药物对一些恶性肿瘤进行治疗时,显示出了良好的治疗效果和极低的副作用,这促使我们研究利用光激活的金丝桃素抑制RINm5F胰岛瘤细胞增殖的可行性,并探讨其作用的基本机制。我们的实验结果表明,用金丝桃素孵育RINm5F细胞,在加药20分钟后,细胞内即可检测到金丝桃素,在加药60分钟后,金丝桃素在细胞内的积累达到最大峰值。金丝桃素在细胞内的定位与质膜结构密切相关,其定位在细胞的质膜结构区域内,尤其显著地积累在细胞质中。利用荧光标记和激光共聚焦技术,我们发现金丝桃素能够定位在细胞质内的内质网、高尔基体以及线粒体等细胞器上。对进入细胞内的金丝桃素进行光激活,细胞的形态会发生改变。光激活的金丝桃素能够通过抑制增殖和诱导凋亡的方式降低RINm5F细胞的活力。
金丝桃素抑制细胞增殖的作用主要体现在降低细胞中增殖蛋白Ki67的表达,以及诱导细胞发生G0/G1期细胞周期停滞。而且,金丝桃素的抗增殖作用是通过下调MAPK信号通路中JNK和ERK的磷酸化水平实现的。光激活的金丝桃素还可以激活细胞内的caspase-9和caspase-3,改变bax和bcl-2的表达比率,诱导RINm5F发生细胞凋亡。
此外,我们用IlluminaNextseq 500对金丝桃素处理过的细胞进行了RNA-Seq测序分析,测序数据与之前的实验结果相符,从基因表达的水平上证明了金丝桃素影响细胞增殖及凋亡相关基因的表达。综上所述,本文的研究结果为实现以金丝桃素作为光动力学药物应用于胰岛细胞瘤的治疗打下了坚实的基础。
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