一、背景
人皮肤鳞癌细胞源自一位患有皮肤鳞状细胞癌的85岁女性，是GiardDJ等人建立的一系列细胞株中的一株。该细胞在免疫抑制小鼠体内可成瘤，在琼脂上培养可形成克隆；是一个超三倍体人细胞株。
二、人皮肤鳞癌细胞传代方法
a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
b、加1 mL消化液(0.25%Trypsin-0.02%EDTA)于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1-4min(视细胞情况而定)，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加2-3ml完全培养基终止消化。轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心5 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。
c、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。
三、人皮肤鳞癌细胞冻存方法
a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，加1 mL血清重悬细胞，进行细胞计数。
b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5x106～1x107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。
c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
四、应用
人皮肤鳞癌细胞可以用于骨化三醇联合5-氨基酮戊酸己酯光动力对人皮肤鳞癌A431细胞的影响及其机制研究：
骨化三醇能够改变外源性光敏剂ALA在血红素合成途径中关键酶的表达从而导致产生更多的PpⅨ,而骨化三醇对于HLA是否有协同的作用,从而更加进一步地增强光动力的疗效,目前尚未见相关研究报告。
研究目的：研究骨化三醇联合5-氨基酮戊酸己酯光动力对人皮肤鳞状细胞癌的体外疗效,为将来临床上提高对皮肤深在性肿瘤的光动力疗效提供参考依据。
研究方法：
1、检测HLA孵育A431细胞后PpIX的荧光强度,用CCK8检测不同浓度骨化三醇、HLA-PDT以及联合组对人皮肤鳞状癌A431细胞的抑制作用,引入药物联合指数CI(combination index)来评价联合组是否为协同作用及强度,同时决定后续实验的参数。
2、通过观察细胞形态、细胞划痕实验、细胞活死染色、ROS的生成量以及线粒体膜电位的改变来比较ALA、HLA两种光敏剂以及分别联合骨化三醇后对A431细胞的作用。
3、对联合处理后细胞的周期检测、细胞死亡方式、血红素合成途径关键酶以及凋亡相关蛋白的mRNA表达水平进行检测,旨在进一步探究联合治疗发挥作用的可能途径。
研究结果：
1、含HLA的细胞培养液在浓度低于200μM时,对A431细胞没有产生明显毒性;低浓度的骨化三醇溶液(0.01nM～100nM)对A431细胞增殖无明显的影响,浓度为1000nM时对细胞的抑制率随药物浓度、孵育时间的增加而增强;HLA-PDT对A431细胞的抑制作用呈HLA浓度及光照强度依赖性;与单一处理组比,Comb组抑制作用增强,当发挥半数抑制效果时,骨化三醇浓度83.5nM,HLA浓度83.5μM,光照能量为2.4J,CI=0.29,呈强协同作用。
2、与ALA相比,HLA-PDT对细胞抑制作用、杀伤作用更强,更加提高ROS的水平以及使MMP下降等更多,骨化三醇联合后能够进一步增强ALA-PDT以及HLA-PDT的作用。
3、联合处理后更多细胞被阻滞在G0/G1期、相对单一处理组凋亡细胞更多、血红素合成途径关键酶ALAD、HMBS、CPOX的mRNA表达上调,FECH表达上调不明显,凋亡相关蛋白的Caspase-3、Bax的mRNA表达上调,提示骨化三醇联合HLA-PDT可通过凋亡途径诱导A431细胞死亡。
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