一、背景
THP-1细胞是1980年Tsuchiya等人建立的人单核细胞白血病细胞系。它来自一位急性单核细胞白血病患者的血液，有分化为多种巨噬细胞的能力，是各领域研究常用的细胞系之一。
二、细胞常规培养步骤（请严格遵守无菌操作）
1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中，加入约6ml培养基，培养过夜），第二天换液并检查细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
细胞名称：THP-1人单核细胞白血病
生长特性：悬浮形态特性淋巴母细胞样
培养条件：RPMI-1640+10%FBS+1%双抗
生长条件：气相：5%CO2；95%空气温度：37℃
传代方法：1:2传代，2~3天换液/传代
冻存条件：90%FBS+10%DMSO支原体检测阴性
对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：
1、弃去培养瓶中上清液，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2、加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加6ml完全培养基，轻轻吹打细胞层，尽量把细胞层吹落、吹散。
3、吹打匀后吸出，在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4、将细胞悬液按1：2到1：4的比例分到新的含6ml培养基的新皿中或者瓶中。
三、应用
用于类风湿关节炎患者外周血维生素D水平及活性维生素D调控lncRNA HOTAIR影响THP-1细胞功能的研究：
探讨RA患者内源性VitD水平及其与血清细胞因子、Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞、Treg细胞及疾病活动度的相关性,在此基础上,进一步明确补充外源性1,25（OH）2D3影响THP-1细胞功能的机制,并阐明HOTAIR在其中的作用。
方法：
1、选取确诊的初发RA患者及年龄性别匹配的健康对照各54例,采用ELISA检测25（OH）D3水平,改良流式细胞术（flow cytometry,FCM）检测淋巴细胞亚群绝对数量,流式细胞术微球芯片捕获技术（cytometric bead array,CBA）检测血清细胞因子水平,DAS28（ESR）评估疾病活动度。
2、通过体外慢病毒载体介导的HOTAIR过表达及基因沉默干扰HOTAIR对THP-1细胞进行感染,构建体外细胞培养体系,并将其分为HOTAIR表达增强组、过表达阴性对照组、HOTAIR表达抑制组、干扰阴性对照组、空白对照组。通过Deltavision Ultra观察细胞状态及活性,FCM测定感染效率,嘌呤霉素盐酸盐筛选稳定感染的细胞株,并扩大培养成功感染的细胞株。各组分别加入不同浓度（10,30,100）n M/m L的1,25（OH）2D3,对照组给予等量乙醇,37℃,5%CO2培养4,24及48小时后分别收集细胞。通过Real-time PCR检测HOTAIR、VDR、IL-1β及NF-κB在转录水平的表达,分析1,25（OH）2D3对THP-1细胞功能的影响。
结果：
1、与健康对照组相比,RA患者25（OH）D3水平显著降低（p<0.001）,Th1细胞、Th17细胞的百分比与绝对值均明显升高（p<0.05）,Th2细胞、Treg细胞的百分比与绝对值均明显降低（p<0.01）。此外,RA患者IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α及IFN-γ水平均明显高于健康对照组（p<0.001）。同时,25（OH）D3水平与DAS28、ESR、CRP、Ig M、IL-6、IL-17呈明显负相关（p<0.05）,与CD4+Th细胞、Treg细胞呈明显正相关（p<0.05）。
2、感染48h后,Deltavision Ultra观察到HOTAIR表达增强组、过表达阴性对照组、HOTAIR表达抑制组、干扰阴性对照组细胞状态良好,均有绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）表达。嘌呤霉素盐酸盐筛选后,FCM检测结果显示各组细胞GFP表达效率大于90%。HOTAIR表达增强组THP-1细胞表达HOTAIR mRNA水平显著高于对照组、空白组及干扰组,差异有统计学意义（p<0.05）,HOTAIR表达抑制组THP-1细胞表达HOTAIR mRNA水平显著低于对照组、空白组及过表达组,差异有统计学意义（p<0.05）。HOTAIR表达增强组、过表达对照组、HOTAIR表达抑制组、干扰对照组及空白组VDR、NF-κB mRNA水平无显著差异（p>0.05）。值得注意的是,HOTAIR表达增强组IL-1βmRNA水平显著高于空白组、HOTAIR表达抑制组及对照组,差异有统计学意义（p<0.05）。
3、空白组THP-1细胞表达HOTAIR、VDR和IL-1βmRNA水平受1,25（OH）2D3的调控,且与刺激浓度和作用时间相关;但NF-κB mRNA水平无显著差异（p>0.05）。此外,在HOTAIR表达增强组,1,25（OH）2D3可降低THP-1细胞表达HOTAIR、VDR和IL-1βmRNA水平（p<0.05）,但随着1,25（OH）2D3浓度的增加和作用时间的延长NF-κB的表达水平未发生显著改变（p>0.05）。在干扰HOTAIR后,1,25（OH）2D3亦可降低THP-1细胞表达HOTAIR和VDR mRNA水平（p<0.05）,但对IL-1β的调控作用减弱。结论:维生素D可能是RA发生发展的重要因素,且活性维生素D可通过HOTAIR调控THP-1细胞的功能并抑制细胞因子转录水平的表达。
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