一、背景及概述
成骨细胞系生长期骨的一种细胞。此种细胞多聚集在新形成的骨质表面。成骨细胞呈矮柱状或立方形，排列较规则整齐，很象单层上皮细胞。可见细胞伸出细短的突起与相邻的细胞连接。胞核位于细胞的一端，有明显核仁。胞浆呈嗜碱性，内有线粒体和高尔基体。当成骨细胞功能活动旺盛时，胞浆中可显示碱性磷酸酶的活性、PAS阳性反应的小颗粒，胞浆中含有大量的RNA。成骨细胞具有产生细胞间质中纤维和粘多糖蛋白的作用。新的细胞间质不断产生，并经过钙化形成骨质，成骨细胞被包埋在其中胞内活动停止，胞浆减少，胞体变形，转变为骨细胞。成骨细胞的分离培养方法主要有组织块法和酶消化法，主要取材部位为新生鼠长骨及颅骨。体外分离培养成骨细胞是研究其生物学特性与功能调节的重要工具。
成骨细胞的培养至今大约有40余年的历史，最初是Peck等于1964年使用胶原酶消化首次成功分离新生大鼠成骨细胞，1975年采用多次胶原酶消化法纯化得到的成骨细胞。20世纪80年代，低钙培养骨片获得人成骨细胞。有研究证实骨组织中各类细胞耐受消化酶能力依次为：成纤维细胞<破骨细胞<骨祖细胞<成骨细胞。有实验将分别使用组织块法及两种不同的酶消化法共3种方法分离获取成骨细胞，探索出分离率高、耗时短、成活性好、操作方便的成骨细胞分离方法。为临床骨相关疾病治疗、骨生物学特性研究提供稳定高效的成骨细胞体外分离方法。
二、原来培养
1）组织块法取大鼠成骨细胞：将新生SD大鼠(72h内)5只浸泡在体积分数75%乙醇烧杯中3-5min，无菌条件下剪开头部皮肤，取出颅骨，放入盛有D-Hanks(含青霉素3×105U/L、链霉素3×105U/L)缓冲液的培养皿中，刮去骨膜及骨缝间结缔组织，剪成约1mm×1mm大小的骨片，以D-Hanks液洗3次，加入等量0.25%胰蛋白酶消化10min，加入含体积分数10%新生小牛血清的DMEM培养液终止消化，然后将碎骨片均匀接种于培养瓶中，翻转培养瓶置于培养箱中，3h后转正培养瓶。21d后换液，细胞长满瓶后传代培养。
2）胶原酶消化法：取新生SD大鼠(72h内)5只，即SD乳鼠浸泡于体积分数75%乙醇的烧杯中消毒3-5min，无菌条件下剪开头部皮肤，取出颅骨，放入盛有D-Hanks(含青霉素3×105U/L、链霉素3×105U/L)缓冲液的培养皿中，刮去骨膜及骨缝间结缔组织，剪成约0.5mm×0.5mm大小的骨片，以D-Hanks液洗3次，加入等量0.25%胰蛋白酶消化10min，弃掉胰酶，加入消化液10只/2.5mL(Ⅰ型胶原酶5mg、透明质酸酶2.5mg，DMEM培养液配制)，37℃恒温条件消化20min，每5min摇匀1次，让消化液与骨片充分接触。吸走弃掉消化液，再加入2.5mL消化液在37℃恒温条件下消化90min。用等量含血清培养液终止消化，将消化液转移至离心管中。用培养液将骨块洗3次，吹打骨块，同样转移液体到离心管中。离心1000r/min，6min沉淀细胞，含血清培养液重悬细胞，放入体积分数5%CO2饱和湿度条件下于恒温培养箱37℃培养。差速贴壁法纯化成骨细胞，待细胞长满瓶底传代培养。
3）分段胶原酶消化法：取新生大鼠(72h内)5只，即SD乳鼠浸泡于体积分数75%乙醇的烧杯中消毒3-5min，无菌条件下剪开头部皮肤，取出颅骨，放入盛有D-Hanks(含青霉素3×105U/L、链霉素3×105U/L)缓冲液的培养皿中，刮去骨膜及骨缝间结缔组织，剪成约0.5mm×0.5mm大小的骨片，以D-Hanks液洗3次，加入等量0.25%胰蛋白酶消化10min，弃掉胰酶，加入消化液10只/2.5mL(Ⅰ型胶原酶5mg、透明质酸酶2.5mg，DMEM配制)，37℃恒温条件消化20min，每5min摇匀1次，让消化液与骨片充分接触。吸走弃掉消化液。再加入2.5mL消化液。37℃恒温条件消化20min，收集细胞悬液，离心1000r/min，5min沉淀细胞，将上清转移至骨片继续消化重复6个循环。每次沉淀的细胞都要用含血清培养液重悬。最后将所有细胞悬液收集离心，含血清培养液重悬，放入体积分数5%CO2饱和湿度条件下于恒温培养箱37℃培养，差速贴壁法纯化成骨细胞，待细胞长满瓶底传代培养。
4）结果：酶消化分离所得细胞接种于培养瓶，24h后细胞充分伸展，呈梭形、三角形或不规则多边形。植块法细胞围绕骨片生长，细胞呈长梭型。培养2d后，胶原酶消化法获取的成骨细胞呈现多边形并有长突起；组织块法获取的成骨细胞呈现长梭状并有长突起。分离细胞皆有成骨细胞典型特征。
三、应用
成骨细胞的培养至今大约有40余年的历史，最初是Peck等于1964年使用胶原酶消化首次成功分离新生大鼠成骨细胞，1975年采用多次胶原酶消化法纯化得到的成骨细胞。20世纪80年代，低钙培养骨片获得人成骨细胞。有研究证实骨组织中各类细胞耐受消化酶能力依次为：成纤维细胞<破骨细胞<骨祖细胞<成骨细胞。有实验将分别使用组织块法及两种不同的酶消化法共3种方法分离获取成骨细胞，探索出分离率高、耗时短、成活性好、操作方便的成骨细胞分离方法。为临床骨相关疾病治疗、骨生物学特性研究提供稳定高效的成骨细胞体外分离方法。
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