一、背景
人胚肾细胞来源于以腺病毒5 DNA进行转化的肾细胞，适于滴定人腺病毒。细胞表达一种不寻常的由整联蛋白beta-1亚基和玻联蛋白alpha-v亚基组成的玻联蛋白细胞表面受体。Ad5插入片段进行了克隆和测序，结果表明碱基1-4344插入到了19号染色体（19q13.2）。293细胞比较容易转染，是一个很常用的表达研究外源基因的细胞株。293细胞的缺陷是生长过程中贴壁强度比较小。所以在实验过程中容易流失，从而影响实验结果。
二、复苏操作
1）将培养基在37℃水浴锅预热；准备一个15mL无菌的离心管，加入8mL预热培养基。
2）将冻存细胞从液氮罐中取出，快速放入37℃水浴锅中复温（可准备一洁净的烧杯，装满37℃的水，细胞冻存管取出后迅速放入烧杯内，再逐步转移到水浴锅中）。轻轻晃动冻存管，使细胞能在1~2min内完全解冻，使细胞能尽快通过最易受损的温度段（-5~0℃）。注意冻存管管口不能没入水中，BRL(大鼠肝细胞)避免引起污染。
3）用75%酒精擦拭冻存管后再置于超净台内，将管内细胞转移至准备好的离心管内，轻轻吹打液体，使细胞均匀分散，降低DMSO浓度，吹打时避免产生气泡。用新鲜培养基洗管壁2次，均转移至离心管内。
4）800rpm离心5min，弃上清，加入新鲜的培养基，吹打制成细胞悬液。
5）将细胞悬液转移至T25细胞瓶内，补加适量的培养基，轻轻晃动细胞瓶使细胞分布均匀，放入温箱内培养。
6）第二天观察细胞贴壁生长情况，换新鲜培养基以去除死细胞。继续培养，待细胞长至80~90%汇合时正常传代。一般刚复苏的细胞需经过2~3次传代，细胞活力恢复后才能进行后续的实验。
三、应用
用于纳米Fe3O4/Cr（Ⅵ）复合物对大肠杆菌及人胚肾细胞的毒性研究：
以Cr（Ⅵ）为典型重金属污染物的代表,利用纳米四氧化三铁吸附水中Cr（Ⅵ）,选择大肠杆菌E.coli和人胚肾细胞HEK293两种不同层级的生物作为模型,研究磁性纳米四氧化三铁吸附Cr（Ⅵ）离子后的复合物对两种生物产生的毒性效应。本研究的浓度作用范围如下:MNPs浓度为250μg/mL,Cr（Ⅵ）浓度分别为1、2、3μg/mL,MNPs吸附不同浓度Cr（Ⅵ）后的MNPs/Cr（Ⅵ）复合物,作用时间为24h。
结果如下：
1、本研究采用共沉淀法,合成了纳米四氧化三铁颗粒（MNPs）,并利用MNPs吸附水中的Cr（Ⅵ）,制备了MNPs/Cr（Ⅵ）复合物。研究发现,MNPs能够有效的吸附水中的Cr（Ⅵ）离子;MNPs对Cr（Ⅵ）的吸附符合Langmuir模型。MNPs/Cr（Ⅵ）复合物呈球形,颗粒大小一致,分布均匀,单分散性好,性质比较稳定。
2、在本研究的浓度范围和作用时间下,Cr（Ⅵ）对大肠杆菌E.coli具有明显的毒性效应,并且与Cr（Ⅵ）浓度呈剂量相关性。在Cr（Ⅵ）离子的作用下,E.coli的生长受到明显的抑制,Cr（Ⅵ）能够引起E.coli内活性氧显著升高,并导致氧化损伤,使细胞结构严重受损。MNPs及MNPs/Cr（Ⅵ）复合物对E.coli没有显著的毒性效应。与空白组比较,生长曲线没有出现明显的变化,在MNPs、MNPs/Cr（Ⅵ）复合物作用下,E.coli内活性氧略微升高,但并未导致明显的氧化损伤。通过透射电镜观察到仅有少量的MNPs、MNPs/Cr（Ⅵ）复合物吸附在大肠杆菌的表面,但细胞膜的通透性及细胞结构没有发生明显变化。MNPs/Cr（Ⅵ）复合物在LB培养基中都是带负电的颗粒,且水合粒径都在200 nm左右,导致MNPs/Cr（Ⅵ）复合物没有进入到大肠杆菌细胞内,仅有少量的MNPs/Cr（Ⅵ）复合物吸附在大肠杆菌表面,尽管产生了少量的活性氧,但不足以导致细胞代谢失衡。因此,MNPs及MNPs/Cr（Ⅵ）复合物对E.coli没有产生明显的毒性效应。
3、在本研究的浓度范围和作用时间下,Cr（Ⅵ）对人胚肾细胞HEK293的毒性效应显著,并且与Cr（Ⅵ）浓度剂量相关。在Cr（Ⅵ）离子的作用下,细胞的形态和密度都发生了显著变化,细胞活力明显下降,同时引起细胞内活性氧显著升高,导致氧化损伤,并诱导了细胞的凋亡。在MNPs、MNPs/Cr（Ⅵ）复合物的作用下,与空白组相比,细胞的形态、密度和细胞活力均没有出现明显的变化。
MNPs吸附Cr（Ⅵ）后,显著降低了Cr（Ⅵ）对HEK293细胞诱导产生的破坏作用,MNPs/Cr（Ⅵ）复合物没有引发细胞的氧化损伤,证实了细胞膜和细胞结构没有受到明显的破坏。在DMEM培养基中,由于MNPs/Cr（Ⅵ）复合物的水合粒径基本都在200～400nm之间,且表面电荷都是带负电,导致绝大多数的复合物不能进入细胞内,MNPs/Cr（Ⅵ）复合物在HEK293细胞内的摄取量极小,这些颗粒是从细胞外通过质膜内陷形成囊泡进入细胞,但没有进入到细胞核中,在正常代谢途径下不会导致细胞的凋亡。因此,MNPs及MNPs/Cr（Ⅵ）复合物对HEK293细胞没有显著毒性效应。
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