由于支原体种类不同，应采取不同的方法进行检测，常用的方法有如下几种。
1、观察细胞的形态和生长特征
支原体污染比较严重时可出现生长减慢，有的培养基pH明显变酸，并出现细胞病变，其病变特征与病毒感染相似，因此不能准确诊断。
2、分离培养法
大多数支原体可出现特有的典型菌落。该方法准确、可靠，但时间长，敏感性不够高。
3、DNA结合荧光素染色法
此法简便、价廉，但若细胞片制备不当则结果难以判断。
4、电子显微镜和免疫电子显微镜法
此法较准确，但受条件限制，时间长，敏感性不高。
5、间接免疫荧光法和免疫印迹
简便、快速、特异性强，如果应用单克隆抗体试剂，效果会更好。
6、PCR技术
快速、敏感性高，但若条件控制不当容易出现假阴性和假阳性。
7、其他方法
放射性核素掺入法、放射自显影法、基因探针法等。
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