破伤风杆菌的致病性及培养与抗菌方法！
小杨 / 2021-10-18 08:52:29
一、背景
破伤风( tetanus) 是破伤风杆菌侵入人体伤口后，在局部生长繁殖并产生外毒素所致的急性疾病。近年来随着毒品成瘾者越来越多采用注射方式吸毒，且其使用的注射针具可能被多种细菌污染，乃至因静脉吸毒者发生破伤风逐年增加，在某些经济发达和吸毒高发地区，甚至已成为破伤风的主要传播途径。破伤风是一种完全可预防的疾病，由于发展中国家的免疫不普及，大部分病例发生在发展中国家，且由于缺乏有效的治疗方法，破伤风仍是一种高死亡率的疾病，死亡率为 20 %～ 30%，重症患者的死亡率可 高达70 %。而如美国等发达国家中亦有较高的发病率。
因此，破伤风仍是一种严重危害人类健康的疾病。破伤风杆菌在自然界中分布极为广泛，很多家畜粪便中都带有破伤风杆菌，人粪中也常带菌。细菌的芽胞常存在于土壤，污泥和尘埃中。不同类型和大小的伤口均可成为破伤风杆菌的入侵门户。
破伤风梭状芽胞杆菌 ( Clostridium．tetani，简称为破伤风杆菌) 是一种革兰阳性厌氧芽胞杆菌，是破伤风( Tetanus) 的病原菌。它侵入伤口内繁殖、分泌内毒素且引起急性的特异性感染，主要表现为全身或局部肌肉的持续性收缩和阵发性痉挛。1962 年，Latham 开发出了适合破伤风芽胞杆菌生长的半合成培养基，此培养基含有胰酶消化酪蛋白，至今仍广泛使用。
二、致病性
破伤风杆菌能产生两种在氨基酸结构上基本相似的外毒素，即 溶血 毒素 ( Hemotoxin)和破伤风痉挛毒素( tetanospasmin)。溶血毒素在功能和抗原性与链球菌溶血毒类 O 相似，目前此毒素在破伤风致病中的作用尚未明确。破伤风痉挛毒素是一种蛋白质，不耐热，56 ℃ 30min即可被破坏。可被肠道中存在的蛋白酶所降解，故口服该毒素无致病作用。
痉挛毒素在菌体内合成时是一条多肽链，分子量 160KDa，可在蛋白水解酶作用下裂解成一条轻链(分子量为 55KDa)和 一条重链 (分子量为105KDa)，两条肽链分开后，各部分的血清学特性仍存在，但其毒性消失，重新联合时又恢复其毒性。重链是毒素与神经细胞表面的神经节苷酯结合部位，轻链则具有毒性作用，但必须与重链联合方能致病。破伤风痉挛毒素是由一个大质粒编码，整个毒素基因有 3945 核苷酸，编码 1315 的氨基酸，其中有一段约 20 个氨基酸部分无毒性作用，是刺激人类 T 细胞增殖的决定簇。
破伤风的发病机制是破伤风杆菌芽胞进入缺氧的创口后，在局部发芽繁殖产生痉挛毒素，此毒素通过外周神经纤维间隙，或通过血液，淋巴液等途径到达中枢神经系统，毒素通过重链与脊髓及脑干组织细胞表面的神经节苷脂结合并进入细胞，通过轻链的毒性作用抑制突触未端释放神经介质，抑制了正常的调节功能，产生特有的破伤风临床表现。
三、培养
传统的破伤风杆菌产毒培养基，一般含肉类(乳牛心浸液 BHI) 或乳类( 酪蛋白消化液中的 N-ZCaseR或 N-Z-CaseTTR) 制品，其他还有葡萄糖、氨基酸、维生素、尿嘧啶和无机盐等。已经明，N-ZCaseR或 N-Z-CaseTTR对细菌生长是必需的。目前使用的干酪素胰酶消化液(胰酪消化液)和胃酶牛肉消化液(浓胨水) 是作为破伤风杆菌产毒培养基氮源的主要原材料，但是随着生产规模的扩大，制作一批基础液已经不能保证生产的连续多批次使用。为解决上述问题，从 2008 年开始将破伤风杆菌产毒培养基的主要原材料胰酪消化液、浓胨水、猪肝水透析外液用商品化的类似原材料代替。
先保持胰酪消化液、浓胨水和其他组分不变，尝试应用肝浸粉替代猪肝水透析外液，并从培养基制备量小( 60 L)逐步扩大到制备量为 120 L、300 L、700 L 各 6 批，通过生化检测和破伤风杆菌产毒水平试验，同时用猪肝水透析外液的培养基接种破伤风杆菌的产毒水平进行对比，其结果显示差异无统计学意义。因此，用肝浸粉可以替代猪肝水透析外液。
接着尝试应用胰酪胨替代胰酪消化液制备破伤风杆菌产毒培养基 11 批，试验产量为 18L，同时以胰酪消化液和浓胨水为基础液的培养基 540 L，对其生化指标质量控制和接种破伤风杆菌的产毒情况进行了比较： 2009 年，用胰酪胨和不同的月示胨作试验培养基，同时用胰酪消化液和浓胨水为基础液的培养基 540～670 L，对质量控制生化指标和细菌产毒情况进行了对比，选择出一种可用的月示胨以替代原来的浓胨水。
2010 年上半年菌种用培养基沿用传统的原材料配制，试验选用胰酪胨和月示胨制备破伤风杆菌产毒培养基制备量 54 L 30 批次，同时使用胰酪消化液和浓胨水为基础液进行质量控制和破伤风杆菌产毒水平对比： 2010 年下半年菌种用培养基选用胰酪胨和月示胨，试验选用胰酪胨和月示胨制备破伤风杆菌产毒培养基，制备量依次为 36、72、500和 520 L 各 3 批次逐渐扩大，检测培养基的质量控制生化指标和产毒情况进行试验，完成从小量到大量的原材料替代试验。
而 2012 年，选用的胰酪胨和月示胨替代传统自制的胰酪消化液和浓胨水制备破伤风杆菌产毒培养基，大罐制备量为 500 L 共 48 批次，其培养基检测的各项生化指标稳定，产毒能力良好，表明肝浸粉、胰酪胨和月示胨替代传统原材料制备的培养基易于生化指标的质量控制，可适用于破伤风杆菌产毒规模化的生产。
四、抗菌方法
有实验构建和纯化抗破伤风杆菌信息菌素（pH-CT），并初步检测其抗菌活性。从分泌针对破伤风杆菌表面抗原的单克隆抗体的杂交瘤细胞中扩增出抗体可变区基因序列，利用双联寡核苷酸点突变技术将抗体模拟物与大肠菌素融合构建pH-CT，经离子交换柱纯化后，通过菌落培养加入不同剂量信息菌素pH-CT（ 终浓度2、4、8、16μg/mL），观察pH-CT 的体外抗菌活性。通过培养液中接种破伤 风杆菌，并加入不同剂量的pH-CT（ 终浓度4、16μg/mL），厌氧培养16h后取滤液及菌液行小鼠腹腔注射，观察pH-CT 的体内抗菌活性。
结果成功构建抗破伤风杆菌pH-CT。体外实验结果显示，涂布加入pH-CT2、4μg/mL 孵育菌液的固体培养基上仍见破伤风菌落生长，而涂布加入pH-CT8、16μg/mL 孵育菌液的培养基上均无菌落生长；体内实验结果显示，滤液和菌液组中对照组小鼠1d内均全部死亡，滤液组pH-CT4、16μg/mL 组小鼠3d内全部存活，菌液组中pH-CT４μg/mL组小鼠3d内存活3只（50％），pH-CT16μg/mL 组小鼠3d内全部存活。因此构建的pH-CT在体内和体外都表现出对破伤风杆菌有抗菌活性，为临床治疗破伤风提供了新思路和新途径，具有应用于临床的潜在价值。不同浓度pH-CT对破伤风杆菌 CMCC（B）64067的抑菌作用图如下：
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