人胚胎干细胞（hES）培养Protocol
微生物查询网 / 2015-03-26 12:20:16
人胚胎干细胞（hES）培养Protocol
MEF细胞铺制：
1，在T25培养瓶中加入5% Matrigel，摇匀后覆盖底面即可，于37℃细胞培养箱中至少放置30 min以上。
2，吸除Matrigel，加入事先水浴加热至37℃的MEF完全培养液。一般地，一个T25培养瓶中加入5 ml MEF完全培养液。
3，按实验需要复苏MEF若干支。将冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超净台内用75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。
4，将冻存管内细胞悬液转移至含2 ml MEF完全培养液的15 ml离心管内，以 1000 rpm，离心5 min，离心后将上清液吸除，另加入新鲜的MEF完全培养液1 ml，重悬后按照一个T25培养瓶铺1?106的MEF细胞，平均加入到T25 培养瓶，轻轻摇匀后置于37℃细胞培养箱。48h以后可以传入人胚胎干细胞。
5，复苏或传代
hES细胞前，将T25培养瓶中的MEF完全培养液吸除，加入2 ml hES完全培养液轻轻冲洗一遍后吸除，加入新鲜的hES完全培养液待用。
复苏：
1，将hES细胞冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超净台内用75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。
2，将冻存管内细胞悬液转移至含3-4 ml hES完全培养液的15 ml离心管内，以1000 rpm，离心5 min。
3，离心后将上清液吸除，另加入新鲜的hES完全培养液2-3 ml，吹打一次使细胞悬浮。
4，转移至1个已经铺好MEF细胞的T25培养瓶中培养。
5，复苏第二天不换液，第三天起每天更换hES细胞完全培养液。
注意：复苏后48小时换液，期间最好不要挪动细胞。hES复苏后大约4-5天才开始有克隆出现。
传代：
1，一般在复苏后第7-10天传代，正常传代为7天一次。
2，吸除废液。
3，用PBS（不含钙镁离子）轻轻冲洗一遍。
4，加入4-5 ml的1 mg / ml的Collagenase-type IV至培养瓶，轻轻晃动，使之覆盖底面，置于37℃培养箱内消化细胞。
5，在显微镜下观察，直至克隆边缘大部分脱落（一般需要30-60 min）。
6，用10 ml移液管轻轻吹打，将克隆吹下，细胞悬液转移至15 ml离心管中，放置一会，待克隆自然沉降后将上层Collagenase-type IV吸除，加入hES完全培养液3 ml，放置一会，待克隆自然沉降后将上层培养液吸除。
7，加入的hES完全培养液3 ml，用10 ml移液管吹打2-3次，细胞自然沉降，将上层吹打的过小的克隆及培养液吸除，加入hES完全培养液3 ml，悬浮细胞，按照1:4的比例进行传代。
8，放入37℃培养箱内培养。
9，第二天不换液，第三天起每天换液，换液前显微镜下将分化的克隆挑除。
注意：复苏后48小时换液，期间最好不要挪动细胞。hES复苏后大概4-5天才开始有克隆出现。
冻存：
2，细胞自然沉降，吸除上层培养液，逐滴加入已经预冷的冻存液，轻轻悬浮细胞。
3，按每支冻存管内加入500 ml细胞悬液分装到冻存管内，标记细胞名称、代数、冻存日期等基本信息。
4，将冻存管置于程序降温盒内，-80℃过夜，转入液氮。
冻存液配方：
hES完全培养液60%，ES级FBS 30%，DMSO 10%
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