C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞完全培养基的应用！
小杨 / 2021-03-01 08:48:44
一、背景
C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞完全培养基添加了能有效改善细胞生长状态的营养物质和特别甄选的优质胎牛血清，适合C57BL/6小鼠骨髓间质干细胞的体外培养。间充质干细胞(MSC)是属于中胚层的一类多能干细胞，主要存在于结缔组织和器官间质中，以骨髓组织中含量最为丰富，由于骨髓是其主要来源，因此统称为骨髓间充质干细胞。
间充质干细胞最初是由Friedenstein等人于1987年发现的一类成纤维细胞样细胞，易于贴附于塑料培养板表面，目前发现骨髓间充质干细胞具有向骨、软骨、脂肪、肌肉、肌腱、神经等组织分化的潜能。在机体内间充质干细胞存在于骨髓、胎盘、脐带、羊膜、脂肪等组织中，尤以骨髓中数量较多、分化能力最强。
骨髓间充质干细胞具有向中胚层和神经外胚层来源的组织细胞分化的能力，这些细胞包括成肌细胞、肝细胞、成骨细胞、软骨细胞、成纤维细胞、神经胶质细胞、神经细胞、造血干细胞、基质细胞等，在两性霉素B和5-氮胞苷作用下，还可形成肌小点，骨髓间充质干细胞用于中胚层和神经外胚层来源的组织损伤及退行性病变的治疗前景巨大。
动物实验已经证实，骨髓间充质干细胞单独应用可以较好地促进骨折愈合和软骨损伤的修复，通过体外培养使其覆盖于陶瓷支架或碳纤维网络等再植入患处效果更明显。骨髓间充质干细胞体外培养，因具有黏附于塑料培养皿壁的能力而易于分享，体外经过长期连续培养和冷冻保存后不会改变其分化潜能，植入以后可以分化成造血以外的组织，如肺、软骨、骨、神经等，并表现出相应组织细胞的表型。
二、应用
用于L型钙离子通道阻滞剂贝尼地平对C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的体内外研究：
骨间充质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSC)大量存在于骨髓腔中,是成骨细胞和脂肪细胞的前体细胞,并具有分化成神经细胞以及软骨细胞等的潜力。作为研究骨代谢的良好工具细胞,对BMSC成骨分化的干预能明显影响机体的成骨能力,作为成骨细胞的祖细胞,BMSC上发现的成骨证据可对成骨细胞的生理作用产生较大影响。
目前,随着对骨代谢研究的深入,药物干预可作为长期手段影响BMSC的成骨分化,为临床上干预骨质疏松提供前期实验依据。贝尼地平作为临床上常用的降血压药物,其主要机制是通过调控血管平滑肌细胞上的L型钙离子通道的开闭,进而调控平滑肌的收缩舒张,最终调控全身血压。作为抗高血压的常用药物,贝尼地平具有持续干预的潜力。
此外,目前贝尼地平对骨代谢的在体作用仍不明了,因此,本实验通过观察贝尼地平对BMSC的成骨分化影响,以及贝尼地平灌胃去卵巢C57/BL骨质疏松模型小鼠来探讨钙离子通道阻滞剂对骨代谢的作用及机制。
取原代BMSCs所用的雌性4周大C57/BL6小鼠,体重10-15g,购至内蒙古农业大学实验动物中心；主要实验仪器与试剂：(1)主要仪器：倒置光学显微镜(Nikon,TE2000-U),(2)主要试剂：一抗Runx2(CST公司),一抗OCN(CST公司),一抗GAPDH(CST公司),一抗β-catenin(CST公司),一抗LRP5(CST公司),ALP染色试剂盒(碧云天生物试剂公司),Caspase-8比色测定工具包(凯基生物公司),贝尼地平(Sigma公司),α-MEM(Hyclone公司),胎牛血清(Gibco公司)。
BMSCs的提取与培养小鼠寰枢椎脱臼处死后75%酒精浸泡消毒5分钟,在超净台中用眼科剪和眼科镊剥开小鼠皮肤,从髋臼关节处取下小鼠双下肢,PBS清洗掉粘连毛发,剥离附属肌肉等软组织整理出股骨,浸泡于α-MEM基础培养基中,用一套新的灭菌眼科剪和眼科镊剪开股骨双侧骨端暴露骨髓腔,用1 ML注射器吸取10%FBS的完全培养基冲出骨髓,反复并两端交换冲洗,待骨头发白后将含有骨髓的完全培养基转移至干净的15 ML离心管,800 r/min低速离心5分钟,骨髓重悬后转移至10 cm培养皿中5%的CO2下37℃培养,培养基3天更换1次。