卡他莫拉菌(moraxellacatarrhalis ,MC)为革兰阴性双球菌, 原属奈瑟菌属(Neisseria catarrhalis ,NC), Catlin 在1970 年将此菌分类为布兰汉菌属(Branhamellacatarrhalis , BC), 1984 年在伯杰分类细菌学手册中被列为莫拉菌属的布兰汉亚属(subgenus branhamella)。MC 是人类上呼吸道的常居菌种, 为条件致病菌。该菌可引起人类的多种感染, 可累及全身。国外资料显示,MC 在成人下呼吸道感染及儿童肺炎、中耳炎等标本中的分离率, 仅次于流感嗜血杆菌和肺炎链球菌列第三位。因此, 快速鉴定MC具有重要的临床意义。我们用3-乙酰吲哚纸片法检测乙酰酯酶, 快速鉴定MC。并测定4 种β内酰胺抗生素的复方制剂及亚胺培南/西司他丁对β 内酰胺酶阳性MC 的抗菌活性。报告如下。
材料和方法
一、材料
1. 菌株来源: MC (228 株)、淋病奈瑟菌(15株)、脑膜炎奈瑟菌(3株)、奈瑟菌属(153 株)、莫拉菌亚属(24 株)、博德特菌属(6 株)、不动杆菌属(138株)均为临床分离株。标准菌株MC 9602 , 9707 , 0101为全国临床检验中心质控菌株,MC 的ATCC 25238 、解乳糖奈瑟菌ATCC 23970 、淡黄色奈瑟菌ATCC14799 、脑膜炎奈瑟菌ATCC13102 、金黄色葡萄球菌ATCC 25923 ,29213 为本实验室菌库保存。
2. 培养基: 5 %羊血琼脂培养基(SBA), 5 %兔血巧克力琼脂培养基(RChoc), 5 %羊血巧克力琼脂培养基(SChoc), 含50 μg/ml 万古霉素的兔血巧克力琼脂培养基(Choc-V), 淋病奈瑟菌培养基(NGA), MH培养基(MHA), 5 %羊血MH 培养基(MHB), 脑心琼脂培养基(BCA), 营养琼脂培养基(NUA), 中国蓝琼脂培养基(ZLA),DNA 琼脂培养基均为本室自制。
3. 试剂: 蛋白胨、DNA 琼脂粉、MH 琼脂粉、VITEK-(NHI 和GNI)鉴定试卡购自生物梅里埃公司。万古霉素为美国礼来公司产品, 盐酸四甲基对苯二胺、3-乙酰吲哚购自SIGMA 公司,Nitrocefin 购自OXOID 公司(英国)。氧化酶纸片(1 %盐酸四甲基对苯二胺溶液浸泡纸片后吹干备用), 乙酰酯酶纸片(100 mg/ml 3-乙酰吲哚丙酮溶液浸泡50 片纸片后吹干备用), Nitrocefin 纸片(12.5 μg/片Nitrocefin吹干备用)。
4. 抗生素: 哌拉西林(PIPC), 齐鲁制药厂产品; 氨苄西林(AMP), 华北制药有限公司产品;哌拉西林/舒巴坦(PIPC/SBT)(4∶1), 海口杰威药物研究所有限公司产品;哌拉西林/他唑巴坦(PIPC/TAZ)(8:1),美国立达公司产品;氨苄西林/舒巴坦(AMP/SBT)(2∶1), 头孢哌酮/舒巴坦(CFP/SBT)(1∶1), 美国辉瑞公司产品;亚胺培南/西司他丁(IPM/CST)(1∶1), 美国默沙东药厂产品。
二、方法
1. 菌株分离与鉴定: 将可疑标本接种于SBA 和Choc-V 琼脂平板上, 置5 %CO2 孵箱, 35 ℃培养24 ～72 h 观察结果。细菌的分离培养和鉴定按文献进行, 分离到的菌株经涂片革兰染色镜检、触酶、氧化酶试验后, 用VITEK-(NHI 和GNI)鉴定试卡鉴定到种。
2. 氧化酶试验: 按文献[ 5] 进行。
3. DNA 酶试验: 按文献[ 5] 进行。
4. 乙酰酯酶试验:用无菌生理盐水将3-乙酰吲哚纸片沾湿, 取待检菌落涂在纸片上, 3 min 内出现蓝绿色为阳性反应。以MC 的ATCC 25238 , 全国临床检验中心质控菌株9602 , 9707 , 0101 作为阳性对照。
5. 生长指数(GI)测定: 取经Rchoc 平板24 h 培养的卡他莫拉菌ATCC 25238 菌落于2 ml 无菌盐水中, 制成0.5 麦氏单位菌悬液, 再用无菌盐水进行1 :10 连续稀释, 取10-5 、10-6 、10-7稀释度菌液100 μl分别接种在9 种培养基上(Rchoc 、Schoc 、Choc-V 、SBA 、MHA 、MHB 、BCA 、NUA 、ZLA), 分别置普通孵箱和5 %CO2 孵箱各1 套, 于35 ℃孵育24 、48 、72 、96 h ,计数少于10 个菌落平板上的菌落数, 并用游标卡尺量出菌落直径, 求其均值(mm), 再乘以此最高稀释度的对数即得GI。
6. β 内酰胺酶试验: 用无菌蒸馏水将Nitrocefin纸片沾湿, 取MC 菌落涂在纸片上, 5 min 内纸片变红色者判为β 内酰胺酶阳性。7 .药敏试验:根据美国临床实验室标准化委员会1998 年版标准, 采用琼脂平皿二倍稀释法测定最低抑菌浓度(MIC),用多点接种仪定量种菌。以金黄色葡萄球菌ATCC 29213 为质控菌株监测整个试验过程, 质控值超出范围者, 该批试验数据作废, 找出原因后重复试验。
结果
1. 氧化酶试验: 228 株MC 、15 株淋病奈瑟菌、3株脑膜炎奈瑟菌、153 株奈瑟菌、24 株莫拉菌、6 株博德特菌氧化酶均为阳性, 138 株不动杆菌氧化酶为阴性。
2. DNA 酶试验: 228 株MC 中DNA 酶全为阳性, 15 株淋病奈瑟菌、3 株脑膜炎奈瑟菌、153 株奈瑟菌、24 株莫拉菌、6 株博德特菌、138 株不动杆菌中DNA 酶均为阴性。卡他莫拉菌对DNA 酶的敏感性为100 %, 特异性为100 %。
3. 乙酰酯酶试验: 15 株淋病奈瑟菌、3 株脑膜炎奈瑟菌、153 株奈瑟菌、24 株莫拉菌亚属、6 株博德特菌乙酰酯酶均为阴性, 138 株不动杆菌中乙酰酯酶阳性114 株(占82.6 %), 228 株卡他莫拉菌乙酰酯酶全为阳性。卡他莫拉菌对乙酰酯酶的敏感性为100 %, 特异性为75.7 %。但与近缘菌(淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、奈瑟菌属、莫拉菌亚属)比较特异性为100 %。
4. β内酰胺酶: 2 28 株MC 中β 内酰胺酶阳性212株, 24株莫拉菌亚属β内酰胺酶阳性5株, 15株淋病奈瑟菌、3 株脑膜炎奈瑟菌、153 株奈瑟菌、6 株博德特菌β 内酰胺酶均为阴性。
5. 不同培养基上的GI 值比较: MC 的ATCC 25238 在ZLA 培养基上不生长;在MHA 、BCA 、NUA 3种培养基上生长不良, 分别经24 , 48 , 72 , 96 h 培养, 与Rchoc 琼脂培养基的GI 值比较, 差异有显著性(P<0.05);MC 的ATCC 25238 在Rchoc 、Schoc 、Choc-V 、SBA 、MHB 5 种培养基上经24 , 48 , 72 , 96 h 培养的GI 值结果比较, 差异无明显意义(P>0.05);5 %CO2环境与空气环境比较, 对GI 值结果影响不明显(P >0.05)。结果如表1 所示。
6. 药敏试验: 如表2 所示, PIPC 、AMP 、PIPC/SBT 、CFP/SBT 、PIPC/TAZ 、AMP/SBT 、IPM/CST 对卡他莫拉菌的MIC50 和MIC90 分别为0.5 , 4.0 , 0.06 ,0.5 , 0.06 , 0.125 , 2.0 , 2.0μg/ml 和2.0 , 8.0 , 0.25 ,1.0 , 0.25 , 2.0 μg/ml ; PIPC/SBT和PIPC/TAZ的MIC50和MIC90分别较单PIPC 降低了8 倍;AMP/SBTR 的MIC50和MIC90较单AMP 降低了32 倍和4 倍。
讨论
MC 与许多严重感染性疾病有关, 但由该菌引起的感染发病率一直难以估计。因为,MC 生长较缓慢, 在不含血的培养基(营养琼脂、MH 琼脂、脑心琼脂)上生长不良, 菌落及菌体形态与许多近缘菌相似, 分离及鉴定较为困难。为此, 提高MC 分离率已成为临床诊断和治疗MC 感染所急需。国外已建立起多种检测MC 的方法, 如丁酸酯酶法、MUB 法、CONFIRM 法及血清学检测法等。国内多采用DNA 酶及硝酸盐还原试验将MC 与近缘菌相区别, 方法既繁琐又费时, 结果也不易判断。我们采用3-乙酰吲哚纸片法检测MC 产生的乙酰酯酶快速鉴定MC , 此法操作简便, 易于判断, 敏感性为100 %, 和近缘菌(淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、奈瑟菌属、莫拉菌亚属)比较特异性为100 %, 与DNA 酶试验及生化鉴定结果的相关性比较均为100 %。虽然不动杆菌的乙酰酯酶阳性率高达82.6 %, 但是不动杆菌的氧化酶阴性, DNA 酶试验阴性, 在普通琼脂及中国蓝琼脂上生长良好, 且菌落较MC 湿润和光滑, 稍加注意不难区别。用3-乙酰吲哚纸片法检测MC 产生的乙酰酯酶, 3 min 即可出结果, 成本较低, 一片纸片可鉴定多个菌落, 可用于可疑菌落的筛选, 是临床实验室快速鉴定MC 的良好方法, 值得推广应用。
在9 种临床实验室常用的琼脂培养基上比较MC 的生长情况, 试验结果表明,MC 对营养要求较高, 在不含血的MH 培养基、脑心琼脂培养基、营养琼脂培养基和中国蓝琼脂培养基上生长不良或不生长。在5 种含血的培养基上MC 的GI 比较结果显示,MC 在巧克力琼脂培养基上比在血琼脂培养基上生长较好, GI 值比较差异无显著性(P >0.05);MC 在不同血源巧克力琼脂培养基上的生长状况比较, 兔血稍好于及羊血(P >0.05)。为提高MC 的分离率, 我们采用含50 μg/ml 万古霉素的兔血巧克力琼脂培养基(加入万古霉素可抑制革兰阳性细菌的生长, 增加了对MC 的选择性)及5 %CO2 条件下对MC 进行分离培养, 并将培养时间延长到72 h , 分离率大有提高。
对228 株MC 的β 内酰胺酶检测结果分析表明,其阳性率高达93.0 %, 应引起临床医生的重视。哌拉西林/舒巴坦、氨苄西林/舒巴坦、头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦及亚胺培南/西司他丁对β内酰胺酶阳性MC 有很好的抗菌活性。在MC 感染的治疗中, 应选用含β 内酰胺酶抑制剂的复方制剂或用对β 内酰胺酶头孢菌素进行治疗。MC 的近缘菌(淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、奈瑟菌属、莫拉菌亚属等)中, β 内酰胺酶的阳性率非常低, 因此, β 内酰胺酶试验也可作为MC 与近缘菌的辅助试验。
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