间充质干细胞培养基的应用与方法！
小杨 / 2020-07-02 08:51:47
一、背景
间充质干细胞培养基是无血清、不含异源动物成分（Xeno-free）的人类干细胞培养基，可促进多种来源的人类干细胞的生长，如骨髓（BM-hMSC）、脐带（UCM-hMSC）。干细胞培养基可促进人类干细胞的长期生长，同时还能保持多向分化潜能。干细胞培养基和干细胞无血清营养添加物共同使用，细胞贴壁及增值效果更好。
二、特点
1、无血清、不含异源动物成分；所有成分都是明确的，且同种来源（人），包括蛋白质；不含抗生素；
2、能够培养不同来源的人类间充质干细胞；
3、维持人类干细胞的长期生长，保留类纤维原细胞形态；
4、极低的背景分化率；
5、维持干细胞的自我更新及多向分化潜能，可分化为骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞。
三、操作说明
间充质干（基质）细胞无血清培养基的制备
1、在实验开始一小时前，将无血清添加剂成分放置于2-8°C进行溶解。溶解完成后，轻轻摇晃试剂瓶使冻融的成分充分混合。
2、使用75%酒精消毒试剂盒中各瓶的开口外壁。
3、待试剂瓶上的酒精挥发干净后，无菌打开各个试剂瓶。
4、将添加剂加入到间充质干（基质）细胞无血清基础培养基中。
5、无菌吸取基础培养基洗涤添加剂瓶，尽可能的将添加剂的所有成分完整的加入基础培养基中。
6、重复步骤两到三遍。
7、轻轻摇晃基础培养基瓶子，使里面的各种成分充分混匀。将配制好的完全培养基放置于4℃保存。
四、应用
用于骨髓间充质干细胞移植联合雌激素治疗宫腔粘连的实验研究：
建立BMSCs体外分离、培养、扩增体系的基础上,对BMSCs进行荧光标记。检测BMSCs在体外一定培养条件下向子宫内膜上皮细胞和／或间质细胞分化的能力及其可能的机制。进一步建立新西兰大白兔宫腔粘连动物模型,将体外扩增的兔BMSCs,标记后直接注射至双侧子宫肌壁间,观察BMSCs在子宫组织的存活和迁移,观察移植后子宫内膜形态学的变化,检测子宫组织和子宫内膜腺上皮特异性标记物基因水平和蛋白表达的改变。
五、方法
1、在无菌条件下取出兔股骨和胫骨,采用全骨髓贴壁细胞分离法分离纯化兔骨髓间充质干细胞,用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培养基培养BMSCs。待细胞铺满瓶底的80%以上,按照1：2～1：3传代培养。
2、采用流式细胞仪检测细胞表面CD44、CD45和CD90的表达,进行鉴定。
3、采用PKH26对BMSCs进行荧光标记,检测即时标记率,通过Annexin-V法检测凋亡率、CCK-8法检测BMSCs的增殖能力,绘制生长曲线,以明确PKH26标记对体外培养BMSCs生物学特性的影响；通过流式细胞仪检测PKH26标记对兔BMSCs表面CD44、CD45和CD90表达的影响。
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