细胞复苏、传代与冻存操作流程
一、 仪器与试剂
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仪器 |
试剂 |
耗材 |
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离心机 |
胎牛血清（FBS） |
离心管（15ml、50ml） |
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生物安全柜 |
无菌1×PBS pH=7.2 |
T-25细胞培养瓶 |
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电动移液器 |
0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA |
一次性无菌移液管（2ml、5ml、10ml） |
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CO2培养箱 |
完全培养基（含血清） |
1.8mL冻存管 |
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倒置显微镜 |
冻存液：90%FBS+10%DMSO |
程序降温盒 |
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液氮罐 |
异丙醇 |
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恒温水浴锅 |
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超低温冰箱 |
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护目镜、厚毛线手套等
二、 操作流程：
复苏
1) 将恒温水浴锅中的水预热到37℃；
2) 准备一支15ml离心管，加入5ml含10%FBS的完全培养基，放入37℃水浴锅中预热；
3) 戴上护目镜，厚毛线手套后，从液氮罐中取出要复苏的细胞，尽快转入37℃恒温水浴锅中复温晃动冻存管以提高复温速率；
4) 将融化了的冻存管中的细胞吸入事先准备的离心管中，混匀后，1000rpm离心5min；
5) 准备一个T-25培养瓶，写上细胞名称、日期，再加入4ml完全培养基；
6) 离心完成后弃去上清，用1ml完全培养基重悬细胞后，转入T-25细胞培养中，混匀后转入CO2培养箱中培养静置。
注意：从液氮中取出细胞冻存管时，若冻存管内有液氮进入，需拧松冻存管，排出内部残留的液氮，之后拧紧冻存管，置于干冰上，然后放入37℃水浴中，避免温差太大造成液氮快速气化而爆炸。
传代 （细胞传代建议一传二）
1) 当细胞汇合度达到85%以上时，可进行传代。
2) 在生物安全柜内，打开培养瓶瓶口，收集瓶内的培养基；
3) 向培养瓶内加入3ml无菌的1×PBS 后，水平放置培养瓶，使PBS能够浸润到培养瓶底面上所有的面积，吸弃PBS；
4) 向瓶内加入消化液1ml，浸润底面后放入37℃ CO2培养箱中孵育1~2min；
5) 孵育完成后在倒置显微镜下观察细胞是否变圆飘起，若全部消化下来则直接向培养瓶内加入2ml含10%FBS的完全培养基中，将悬液吸入15ml离心管；
注：如还有部分细胞未消化下来，可采用分步消化：
① 准备一个无菌的15ml离心管，加入2ml含10%FBS的完全培养基；
② 将消化下来的细胞吸入①中的离心管内中和（避免吹打）；
③ 向之前消化的培养瓶中加入1ml胰酶继续消化2min左右，轻拍培养瓶，95%左右细胞脱落后加入2ml含10%FBS的完全培养基中和，中和后的细胞悬液移入①中的离心管内。
6) 1000rpm离心5min；
7) 准备两个新的T-25培养瓶，各加入4ml完全培养基。
8) 离心完成后，弃上清，用2ml完全培养基重悬离心细胞，将重悬后的细胞转入2个T-25培养瓶，每个培养瓶各1ml；
9) 水平放置培养瓶，震荡混匀后，将培养瓶置于37℃，5%CO2培养箱中静置培养。
冻存 （细胞冻存建议每瓶T25冻一支）
1）~5）参照传代步骤
6）离心完成后，弃上清，用1mL冻存液重悬细胞沉淀，然后转入1.8ml冻存管中；
7）将冻存管转入填充满异丙醇的程序降温盒中，之后转入-80℃冰箱中过夜降温；
8）第二天，取出降温完成的序降温盒中的冻存管，尽快转入液氮罐中保存