小鼠胚胎成纤维细胞的培养方法！
小佳 / 2019-05-14 14:20:06
一、分离方法
1、断颈法处死怀孕12～13天的CF-1小鼠，浸入75％的酒精中消毒。
2、将小鼠放在超净台无菌的解剖盘中，打开腹腔，找出子宫，用剪刀将左右两侧的子宫在输卵管与子宫角的衔接处剪下，小心剪下子宫的联体部分，置于无菌的60mm培养皿中。
3、将子宫置于15ml离心管中，用10ml PBS洗3遍。
4、用尖镊子撕开子宫壁和胎膜，取出胎鼠，放在新的培养皿中。
5、用PBS将胎鼠洗3遍。
6、用灭菌的眼科剪去除胎鼠的胚囊，释放胚胎，并胚胎计数。
7、将胚胎移到干净的培养皿中，PBS洗3次。
8、用镊子小心的去除胚胎的头和肝脏，PBS洗3次。
9、将胚胎转移至新的培养皿中，用无菌剪刀将组织充分剪碎，加入0．25％．胰酶，同时吹打几分钟使其消化完全。
10、用同样体积的MEF完全培养基中和胰酶。
11、一个T75瓶加10m1 MEF完全培养基，将已消化的胚胎加入培养瓶中，放在5％CO2培养箱中培养，培养瓶注明细胞名称、代数及日期。
二、MEF的传代
1、将T75瓶中的MEF培养基吸出。
2、加入胰酶，于37℃的CO2培养箱中放置3～5分钟。
3、取出瓶子，轻轻晃动，可见白色的细胞层开始从瓶子的底壁掉落。用手掌轻拍瓶侧3～5次加快贴壁细胞脱落。
4、加入同等体积的MEF培养基，混匀，吹打几次以形成单细胞悬浮液。
5、将其转移至15ml离心管，以1000rpm的速度离心5分钟。
6、根据细胞数量，将上述细胞均分至若干个新的T75瓶子中，放在5％CO2培养箱中培养，逐日观察。
7、吸去培养液，加3ml 0．25％胰酶至完全覆盖瓶底(以T75为例)。
8、CO2培养箱中孵育3～5分钟，不时轻拍瓶壁，使细胞层脱落。
9、加入同等体积的。MEF培养液中和胰酶，吹打混匀。
10、将其转移至15ml离心管，用电子计数器进行细胞计数后，以1000rpm的速度离心5分钟。
11、移去上清，用少量新鲜的MEF培养液重悬细胞沉淀。
12、缓慢加入等量的MEF细胞冻存液(2×)并混匀。
13、分装上述细胞悬液于2ml冻存管，在冻存管上注明细胞名称、代数、数目、冻存时间。
14、将冻存管放到冻存盒中，-80℃冰箱过夜。根据需要，将冻存管转移至液氮罐中以便长期保存。
本公司拥有对菌种、细胞、培养基、配套试剂等产品需求者的极优质服务，对购买项目的前期资料提供,中期合同保证,后期货物跟踪到最终售后的确保项目准确到位，都有相关人士进行维护,确保您在中国微生物菌种查询网中获得最优质服务！也正因为此，北京百欧博伟生物技术有限公司与国内外多家研制单位、生物制药、第三方检测机构和科研院所院校、化工企业有着良好、长期和稳定的合作关系！