菌种的液氮超低温保藏法！
小吴 / 2019-05-10 14:52:19
1．准备安瓿管
用于液氮保藏的安瓿管，要求能耐受温度突然变化而不致破裂，因此，需要采用硼硅酸盐玻璃制造的安瓿管，安瓿管的大小通常使用75mm×10mm或能容1.2mL液体的安瓿管。
2．加保护剂与灭菌
保存细菌、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的细胞时，将空安瓿管塞上棉塞，0.100MPa、121℃灭菌15min。若作保存霉菌菌丝体用，则需在安瓿管内预先加入保护剂如10%的甘油蒸馏水溶液或10%二甲基亚砜蒸馏水溶液，加入量以能浸没以后加入的菌落圆块为限，而后再用0.100MPa、121℃灭菌15min。
3．制备菌悬液
(1)从生长斜面制备菌悬液每一斜面加入5mL含10%甘油的营养液体培养；用巴氏吸管吹吸斜面制成孢子及菌体细胞悬液。
(2)从浸没培养物制备菌悬液 在浸没培养液中加入等体积20%无菌甘油；轻轻振荡混匀培养液，如果菌体絮凝较紧，则需先用玻璃珠打散。
4．接入菌种
将0.5～1mL菌悬液分装已灭菌的玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精喷灯封口。霉菌菌丝体则可用灭菌打孔器，从平板内切取菌落圆块，放入含有保护剂的安瓿管内，然后熔封。浸入水中检查有无漏洞。将所有封好的安瓿置于5℃冰箱中3min，以使细胞和悬浮培养基之间达到平衡。
5．控速冷冻
(1)将安瓿或液氮瓶置于铝盒或布袋中，然后置于一较大的金属容器中。
(2)将此金属容器置于控速冷冻机的冷冻室中。
(3)以1～2℃/min的致冷速度降温，直到温度达到相对温度之上几度的细胞冻结点（通常为-30℃）；若细胞急剧冷冻，则在细胞内会形成冰晶，因而降低存活率。
(4)补加一定量的液氮至系统中，使细胞在冻结点时尽可能快地发生相变。
如果无控速冷冻机，则一般可将安瓿或液氮瓶置于-70℃冰箱中冷冻4h，然后迅速移入液氮罐中保存。
6．保藏
细胞冻结后，将致冷速度降为1℃/min，直到温度达-50℃；将安瓿迅速移入液氮罐中保存，液氮保藏罐内的气相为-150℃，液相为-196℃。
7．恢复培养
保藏的菌种需要用时，将安瓿管取出，立即放入38～40℃的水浴中进行急剧解冻，轻轻摇动以加速熔解，直到全部熔化为止。再打开安瓿管，用巴氏吸管将安瓿中储存培养物移接入含有2mL无菌液体培养基的试管中，用同一支吸管反复抽吸数次，然后取0.1～0.2mL转接入琼脂斜面上培养。
注意事项如下：
(1)在保藏过程中，如温度上升，冰晶状态发生变化，就容易导致细胞的死亡，因此要经常注意液氮的残存量，定期补充。
(2)冷冻保藏菌种熔化使用后不应再次冷冻保存，反复冷冻、熔化，菌种生存率将显著下降。
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