微生物的研究
微生物组成的特征
高通量DNA测序技术的出现—最初是基于细菌和古细菌16S核糖体RNA扩增子序列的聚类读数，现在是将整个基因组与生命的所有领域相对应—使样本直接分类而无需培养。这些技术进步为剖析来自不同环境中的复杂微生物群落和分析群落结构随时间的变化提供了一种可靠的方法。虽然个体间微生物组的组成不同，有时在个体内部也有明显的波动，但在定植于人体的微生物群落中，其核心特征是存在的1。每个个体生存环境在空间上都是不同的，并且不同程度上由特定的门所支配，不同解剖位点上的特定生境微生物的数量和分布各不相同2。在肠道中，微生物种类的数量和多样性从胃到结肠呈纵向增加3,4，结肠是最密集和新陈代谢最活跃的社区(包括1013个微生物细胞)5。对个体内部和跨个体微生物多样性程度的认识正在影响微生物组研究的方式，从对微生物群落成员的描述性研究转变为对微生物群对健康和疾病的功能作用的机制研究。
微生物功能的研究
整个宏基因组学和元转录组测序工作(来自cDNA文库)正在定义微生物的功能潜力和实时活性，并揭示微生物代谢和宿主发育之间的相互作用。剖析微生物组的调控、动态变化以及宿主基因表达模式的能力揭示了微生物群落的功能是如何影响宿主6，反过来，宿主遗传学如何塑造微生物组的组成和功能7。而且，宿主和微生物组的宏基因组和元转录组的同时测序也为宿主和微生物群的相互作用机制以及健康和患病个体之间的差异提供了深入的见解。此外，随着鉴定和重构基因到更广泛的生物通路的研究工具的发展，已经能够把微生物组的功能特征划分为不同但相关的类别，这些类别对host8(BOX 1)的健康至关重要。
生物化学活性和结构的分析
质谱技术和色谱技术已有一个多世纪的历史;然而，它们只是最近才被应用于宿主微生物组的研究22–24。靶向和非靶向代谢组学和代谢蛋白组学策略都有望揭示合成、设计和天然微生物群落的化学多样性和充分的生化能力。然而，这些技术提出了许多与样品（特别是粪便物质）的提取和处理有关的实验挑战25,26。随着技术障碍的克服，数据分析将继续拓宽我们对微生物组对宿主生理的广泛影响的认识，为开发和测试诊断和治疗方法提供机会。
微生物目标
鉴于微生物群落的丰富性和多样性，分析这些群落中的单个物种和菌株及其相关功能是很重要的，特别是对于未能培养或低丰度的微生物27。这可以通过指定菌株特异性和从整个宏基因组测序数据组装单个基因组的方式来实现28,29，或使用混合捕获和涉及分离和测序稀有物种或单个微生物细胞(BOX 1)的单细胞法。这些方法有望能都推动改善微流体平台和软件应用程序,可以更准确地捕捉和分析微生物多样性和增强对个体遗传变异和功能贡献的理解30。
宿主-微生物相互作用的监测
随着时间的推移，新的工具和技术进步极大地促进了我们对复杂微生物群落及其与宿主的相互作用的理解，涉及到饮食、生活方式的变化以及健康和疾病的状况。然而，对于微生物如何在其首选环境生态位而不是在培养基中相互作用或与宿主细胞相互作用的认识有限。最近的两项研究解决了这一根本挑战。在第一项研究中31，荧光原位杂交(FISH)结合单细胞成像和定量分析软件，来测量肠道微生物的空间组织。饮食摄入对肠道微生物群和宿主的影响的研究表明，缺乏纤维的饮食会导致小鼠肠道内黏液层减少。失去这个防护层导致细菌与肠上皮细胞更接近,反过来,会触发机体生产抗菌肽(AMP)，再生胰岛衍生蛋白3β(REG3β)。微生物可利用的碳水化合物的缺乏极大地改变了不同细菌群的聚集模式。虽然对于微生物的空间分布及其影响微生物群落结构的因素还有很多需要了解，但这种成像和分析方法为研究宿主与微生物的相互作用提供了一种新的途径。第二项研究32利用代谢低聚糖工程(MOE)和生物正交点击化学(BCC)结合全身成像技术对细菌进行体内标记和跟踪。结合这些技术，研究人员能够追踪一种共生细菌在肠道内的分布、与其他物种竞争的能力以及与宿主细胞的相互作用。这种方法有望实时研究宿主-微生物群落的相互作用，获得微生物生态位特异性的“直观的证据”，以及起源于微生物的代谢产物如何调节宿主免疫系统。
代谢产物的免疫调节
虽然宿主和微生物的代谢可以串联发生，但宿主依靠其微生物组来扩大消化酶和代谢酶的聚集33。肠道微生物群产生了极具多样的代谢物库，从到达结肠部的外源未消化饮食成分的发酵物，到微生物和宿主产生的内源性化合物。构成宿主与微生物黏膜界面的单层上皮细胞，使微生物代谢产物能够进入宿主细胞并与宿主细胞相互作用，从而影响免疫反应和疾病风险。
短链脂肪酸
未消化的复合碳水化合物是结肠细菌发酵的丰富底物，其主要代谢终端产物为短链脂肪酸(SCFAs)，包括乙酸、丁酸和丙酸。肠内SCFA浓度(可达20 - 140mm)34取决于微生物组成、肠道转运时间、SCFAs的宿主-微生物代谢通量以及宿主饮食中的纤维含量。这些微生物产生的代谢物不仅是肠道菌群自身的重要能量来源，也是肠上皮细胞(IECs)的重要能量来源。SCFAs除了作为能量产生的局部底物外，还具有多种调控功能，其对宿主生理和免疫的影响还有待进一步揭示。
AHR配体
肠道微生物群的成员及其特定膳食成分代谢所产生代谢物，可以结合宿主细胞上的芳烃受体(AHR)。AHR是一种配体诱导型转录因子，由免疫细胞、上皮细胞和一些肿瘤细胞表达。AHR最初被认为是在异种生物代谢中起作用，但也有证据表明它在调节粘膜免疫反应中的作用。小鼠体内缺乏AHR或缺乏AHR配体，会导致肠道微生物组成受到干扰(即富含拟杆菌的细菌腔负荷增加)，AMP产量、肠上皮内淋巴细胞(IELs)数量和IECs转化率下降63。将野生型小鼠的IELs转移至Ahr-/-小鼠，恢复了IEC屏障功能并使细菌负荷正常化63。在野生型小鼠中，缺乏AHR配体增加了DSS诱导的结肠炎症的严重程度，当给小鼠补充含合成AHR配体的饮食时，该症状减弱63。综上所述，这些研究表明肠道免疫细胞亚群对AHR有内在的要求，因为AHR活性的缺乏会使宿主容易受到增强的免疫激活和免疫病理的影响，而特定饮食成分的微生物代谢对于适当的AHR信号和宿主-微生物共生至关重要。
AHR的激活受饮食和肠道微生物群组成的影响。只有某些细菌亚群，尤其是Lactobacilli spp.，才能代谢膳食色氨酸并产生能刺激ILC3s的AHR配体。ILC3s诱导的IL-22的产生驱动了AMPs的表达，AMPs通过隔离金属离子来抑制病原菌的适应度，从而降低了它们对病原菌的可用性，如Opportunistic fungus Candida albicans65。因此，内源性微生物来源的色氨酸代谢物可能为宿主提供线索，这些线索对于抵抗定植和预防粘膜炎症至关重要。最近的证据表明，AHR具有物种依赖性的配体结合偏好66，表明宿主常见的配体与其微生物群之间的共同进化，作为AHRs的配体，微生物产生的代谢物对宿主免疫至关重要，尤其是在粘膜界面的炎症保护方面。同时值得进一步研究=其作为感染性和炎性疾病治疗的潜力。
微生物的免疫调节
先天免疫系统遇到丰富多样的自身和非自身抗原，并配有种系编码的模式识别受体（PRR），以监测，协调和响应微生物形态的变化。PRR检测细菌，真菌和病毒来源的微生物相关分子模式（MAMP），包括脂多糖，鞭毛蛋白，肽聚糖，甲酰肽和独特的核酸结构。跨膜和胞质的PRRs启动保守的信号级联，驱动对宿主防御至关重要的刺激或调节效应反应。PRR信号通路的激活导致AMPs、细胞因子、趋化因子和凋亡因子的产生，信号通路的中断或改变可能有助于疾病发生。阐明许多微生物产物如何影响PRR介导的反应有助于理解宿主和微生物稳态的发展和维持(图2)。在这里,我们专注于三个主要的MAMPs—多糖(PSA),甲酰肽和D-glycero-β-D-manno-heptose-1,7- bisphosphate (HBP)—这有助于理解宿主和微生物的共生和从宿主和微生物相互作用中实现新的治疗机会。
甲酰肽和HBP的免疫调节。到目前为止，已经鉴定了几种与非经典模式识别受体（PRR）相关的细菌因子，包括多糖A（PSA），甲酰肽和D glycero-β-D-manno-heptose-1,7-biphosphate（HBP）。a:来自Bacteroides fragilis的PSA可以改变脾脏中的CD4+T辅助细胞1（TH1）-TH2细胞平衡（未显示）并且改变外周效应T细胞亚群的平衡。在肠道中，PSA由固有层树突细胞（DC）吸收，并加工并呈递给初始CD4+T细胞。活化的转化生长因子-β（TGFβ）诱导抗炎forkhead box P3（FOXP3）+调节性T（Treg）细胞的扩增和白细胞介素-10（IL-10）的产生，其抑制炎性TH1和TH17细胞的活性。b:由所有细菌释放的甲酰肽结合甲酰肽受体（FPR），其是在中性粒细胞和其他免疫细胞上发现的G蛋白偶联受体。来自金黄色葡萄球菌的甲酰基肽可通过FPR1发出信号，并有助于伤害感受器驱动的机械性疼痛的激活和免疫抑制性神经肽的释放。在高纳摩尔浓度下，金黄色葡萄球菌衍生的甲酰基肽（称为酚可溶性调控蛋白(PSMs)）通过与FPR2结合而刺激大量中性粒细胞流入感染部位。诱导的中性粒细胞活化导致氧化应激的爆发。PSM通过在DC中诱导致耐受性表型并抑制TH1细胞的分化来影响适应性免疫系统。金黄色葡萄球菌还可以通过PSM避开吞噬溶酶体，裂解宿主细胞和分散生物膜，并且还可以杀死竞争细菌（未显示）。HBP是由革兰氏阴性细菌在脂多糖（LPS）生物合成期间产生并在宿主细胞的胞质溶胶中检测到的单糖。由细胞外病原体淋病奈瑟氏球菌分泌的HBP通过TIFA的磷酸化依赖性寡聚化反应诱导先天和适应性免疫应答。TIFA的激活及其随后与TNF受体相关因子6（TRAF6）的相互作用，导致TRAF6泛素依赖性核因子-κB（NF-κB）的激活，从而诱导促炎免疫基因的表达。IFNγ,干扰素-γ; P,磷酸盐; TCR，T细胞受体。
PSA
PSA是八种结构不同的荚膜多糖之一，由Bacteroides fragilis（一种革兰氏阴性共生体，主要存在于结肠的外部粘液层中）产生和输出。这种两性结构对B. fragilis 的生长和有效定植至关重要，并介导其与其他微生物成员和宿主的相互作用。PSA对先天和适应性免疫细胞具有多效性调节作用。PSA与DC上的Toll样受体2（TLR2）相互作用82，并通过CD11c+DCs对其进行取样，处理和呈递给T细胞83,84; 因此，给予PSA可以纠正在无菌小鼠中观察到的T辅助1(TH1)细胞和TH2细胞之间的不平衡83。在脓肿形成和结肠炎的临床前模型中，PSA可以通过激活CD4+T细胞驱动IL-10的产生85，并通过增强IL-10产生CD25+FOXP3+Treg细胞的群体频率和功能来抑制炎症86。虽然PSA在脾脏和胃肠道中得到了广泛的研究，但其抗炎活性却超出这些区域。在神经炎症中，PSA对Treg细胞的作用需要诱导CD39(也称为NTPDase 1)表达，使Treg细胞迁移到CNS87。CD39是一种重要的调节酶，通过将促炎的胞外ATP转化为低炎症的ADP来限制炎症。CD39表面表达是区分人类FOXP3+Treg细胞与初始T细胞或其他效应T细胞群的标志，而人类FOXP3+ Treg细胞上调CD39表达是其抑制活性的必要条件88。近期对人外周血单核细胞的体外研究表明，PSA可增强IL-10产生CD4+ CD39+ FOXP3+Treg细胞的扩增和抑制功能89。Treg细胞中CD39缺乏与无法抑制实验性结肠炎有关，炎症性肠病患者中CD39表达增加与疾病缓解相关90。总之，临床前模型和体外人体细胞实验的机制研究表明，PSA可能是治疗人类自身免疫性疾病的一种有用的免疫调节MAMP。
甲酰肽
由甲酰基肽受体(FPRs)识别的保守的N-甲酰基肽基序存在于细菌中，其密切相关的基序存在于线粒体中。FPRs还可以检测到其他非甲酰化内源性配体，包括血清淀粉样蛋白A，导管素抗菌肽LL-37和蛋白质膜联蛋白A1。FPRs的刺激导致白细胞的募集和促炎细胞因子、酶和过氧化物的产生来抗感染。FPRs由先天免疫细胞、上皮细胞、内皮细胞、肌肉细胞和神经细胞表达，近期研究表明，FPRs对非吞噬细胞的刺激是实现感染或损伤后组织稳态的必要条件19。鉴于FPRs的不同作用和表达谱，FPR异常激活在炎症、自身免疫性疾病、神经退行性疾病和癌症中的作用已被描述。
致病性金黄色葡萄球菌（Pathogenic S. aureus）产生甲酰肽，称为酚可溶性调控蛋白(PSMs)。哪些FPR被PSMs激活取决于PSMs的长度和二级结构，而FPR激活的强度取决于PSM的浓度92。在低水平时，PSMs通过FPR1呈现弱信号，但在高水平时，PSMs是FPR2的强激活剂，诱导显着的中性粒细胞流入感染部位并对宿主细胞和竞争性微生物细胞造成细胞毒性损伤93。FPRs还可与痛觉感受器共同作用，介导金黄色葡萄球菌引起的炎症性疼痛。来源于金黄色葡萄球菌的甲酰基肽通过FPR1，有助于激活伤害感受器驱动的机械性疼痛和免疫抑制性神经肽的释放94。金黄色葡萄球菌还能分泌一些蛋白来抑制FPRs和阻断白细胞迁移95,96。综上所述，这些研究表明，金黄色葡萄球菌通过刺激痛觉感受器释放免疫抑制神经肽，间接抑制宿主免疫系统，并通过FPRs直接抑制，从而允许细菌在感染组织中传播。在感染的后期，随着PSMs的积累，金黄色葡萄球菌可以增强中性粒细胞的细胞毒性活性，进一步损伤宿主细胞和组织。致病性金黄色葡萄球菌的研究突出了宿主对MAMP识别的重要性，以及在疾病早期激活先天免疫反应的新策略的必要性。鉴于甲酰基肽能够有效激活先天免疫系统，肽脱甲酰基酶抑制剂(如放线菌素)是治疗金黄色葡萄球菌等耐药细菌有前途的疗法97。许多细菌编码肽脱甲酰基酶，这些酶的调控是细菌在感染过程中灭活甲酰基肽并阻断白细胞趋化的机制。甲硫氨酰-tRNA甲酰转移酶（一种引发参与蛋白质合成的甲硫基-tRNA甲酰化反应的酶）在金黄色葡萄球菌中基因失活或化学抑制，从而降低其在体内产生强烈感染的能力98。
尽管放线菌素可以驱动在细菌病原体中甲硫氨酰-tRNA甲酰转移酶的功能缺失突变，并对肽脱甲酰基酶抑制剂产生耐药性，这些突变导致体外和体内状态的显著降低99，从而为管理金黄色葡萄球菌感染提供了一种有效的策略。