感觉免疫荧光实验和涂鸦一样随心所欲?实际做起来发现事情并没有那么简单?今天就为大家整理了免疫荧光实验的常见问题，让你体验一把成为细胞“灵魂画师”的快感!
免疫荧光实验步骤+经验总结，做好这些少走弯路!
免疫荧光(Immunofluorescence，IF)，是指利用抗原抗体特异性结合来显示目的蛋白的技术，主要包括直接法和间接法。直接法是蛋白和标记荧光素一抗结合，间接法是蛋白和普通一抗结合，然后再与带有荧光基团的二抗结合。具体实验流程主要包括固定样本、通透细胞膜、封闭、孵育一抗/二抗、细胞核复染、封片等。
免疫荧光实验一般步骤：
1、固定样本
目的是为了长久保持细胞的状态。通过化学试剂处理样本，从而固定细胞结构和蛋白分布。固定剂大体可分为两大类：交联剂和有机溶剂。交联剂大多采用的是甲醛、多聚甲醛等醛类物质，这一类固定剂通过醛基与蛋白质发生交联反应，形成网络，保持蛋白质的位置和结构，是最常用的固定剂。在少数情况下，可能会用到有机溶剂类固定剂，如甲醇、丙酮等。它们是通过变性蛋白质的方式对组织进行固定。
为了在固定过程中最大限度地减少固定剂对抗原和细胞结构的破坏，针对不同的细胞器建议采用不同的固定剂。细胞核膜、细胞核仁、中心体、溶酶体、核糖体、自噬体等建议首选有机溶剂来固定。细胞核、高尔基体、内质网、纤毛、纺锤体、线粒体等建议首选交联剂固定。然而固定剂的选择没有通用规则，倘若没有达到预期效果，可以更换另一种固定剂。
2、通透细胞膜
通透，就是在细胞膜上打孔，使封闭液和抗体能够进入细胞。一般情况下，采用醛类固定剂固定的样本需通透细胞膜，而有机溶剂类固定剂本身就可以通透细胞膜，固定后的细胞不需要再增加通透步骤。通透一般采用表面活性剂Triton-XTM 100。
3、封闭抗体非特异性结合位点
免疫荧光里，需要封闭掉抗体非特异性结合位点，封闭液一般采用与二抗同来源的血清。
4、孵育一抗/二抗
用于免疫荧光的一抗，有些偶联了荧光基团，可直接检测荧光信号，更多的一抗没有偶联荧光基团，需要偶联荧光基团的二抗与一抗结合。一抗的特异性和灵敏度是免疫荧光成功与否的关键。
5、细胞核复染
复染的染料有多种，复染可以在二抗孵育后单独进行，也可以采用含有DAPI的封片剂直接封片。后面的表格中小编给大家总结了CST可用于细胞核复染的染料。
6、封片
为了防止荧光淬灭，还需要使用封片剂，CST的ProLong? Gold Antifade Reagent。对荧光淬灭具有很好的抑制效果。使用这种封片液时，盖好盖玻片后记得将载玻片放在黑暗处固化24hr，达到最佳的防淬灭效果。
以上，就是荧光免疫实验的常规步骤，然而，很有可能，大家在这几个步骤内会出现各种问题，
所以，学霸姐姐列出了一些常见的实验问题，供大家参考：
1，我的抗体标记后在细胞或组织中看到非特异性背景结合，可能是什么原因呢?
原因可能很多，包括封闭不足、一抗或二抗浓度过高或一抗或二抗降解。通过“无一抗”对照加以确定是否是二抗的问题。否则，我们建议你们尝试更严格的封闭或更低浓度的一抗或二抗。
2，我的组织里显示荧光信号到处都是，这是我的二抗吗?
首先，在所有滤光片下检查未染色/未标记的组织，确定这些信号不是由于内源性自发荧光引起的。这一问题在石蜡切片中尤为明显。如果对照仍然显示这是自发荧光，那么可以在封闭和标记前以1mg / mL硼氢化钠洗涤3×10分钟进行还原。
3，我在对照细胞的细胞核和线粒体中看到非特异性结合，但是蛋白质结合不足以将其终止。我应该怎么做?
这种二抗非特异性结合的现象可能是由染料电荷引起的，例如带负电荷的染料被带正电荷的细胞组分吸引。为了阻止该现象，使用Image-iT? FX Signal Enhancer(货号I36933和R37107)能够抑制结合物上的染料与细胞组分之间的电荷作用，进而阻断非特异性结合。
4，,我使用两种不同的抗体标记我的细胞或组织，但是好像出现了交叉标记，每种抗原都出现了相同的染色，为什么会这样?
我们建议您尝试利用单色对照用错误二抗检测一抗，反之亦然，以检查是否存在跨物种标记。结果应该是阴性的。检查二抗产品手册中的交叉吸附种属说明，以确保该二抗与其他种属一抗交叉吸附过。另一种可能性是染料的光谱渗滤到其他波长。单色对照(配对正确)可用于检查此现象。
5，我用二抗标记我的细胞或组织，然后封片观察。但是标记好像褪色或是随时间而变弱了。我该如何阻止这一现象?
包括抗体在内的一些标记亲和力较低，它们会在标记载玻片的储存期间随时间而变弱。为了减缓这种解离速率，可以在加入二抗后将样品用甲醛5-15分钟固定，，用交联的方法将二抗固定交联。也可以用固化封固剂(如ProLong? Diamond Antifade Mountant)封固样品，因为固化封固剂可以减缓二抗的扩散。最后，封固剂完全固化之后载玻片应低温保存(最好是-20 )，从而进一步减缓解离。
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结果展示：
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