沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157等致病菌对食品安全造成很大的危害,能否快速、准确地检测出这些致病菌,是确保食品安全的首要任务。常规致病菌检测方法包括增菌、菌落分离及多种生化试验和血清学鉴定试验,其检测结果虽然准确可靠,但检测过程较长,且步骤烦琐,难以适应现代食品生产与流通的要求,也不能满足HACCP等食品质量安全可知体系的需求。
随着生物、化学、材料科学及计算机领域的发展,新的快速检测和识别方法层出不穷,这些方法包括DNA检测方法、酶联免疫分析(ELISA)、抗原一抗体检测以及常规检测的改进方法。这些病原菌快速检测方法的优点是能从大量食品检样中快速筛选出某种致病菌或毒素。
以下介绍几种致病菌的快速检测方法。
1.沙门氏菌
(1)免疫学方法该法包括AOAC993. 08方法《食品中沙门氏菌单克隆酶免疫比色检测方法》、AOAC989. 14方法《食品中沙门氏菌多克隆酶免疫色度分析筛选方法(TECRA沙门氏菌色度免疫分析方法)》、AOAC992.11方法《食品中沙门氏菌单克隆酶免疫分析和比色筛选法》和AOAC996. 08方法食品中沙门氏菌酶联免疫分析初筛方法分析》。
(2)分子生物学方法 该法包括D\A探针检测法和聚合酶链反应(PCR)技术。DNA探针技术是最新发展起来的一项特异、灵敏、快速的检测方法,特别适合于直接检出致病性微生物,而不受非致病性微生物的影响;PCR技术是由美国于1980年创建,该法已广泛应用于致病性微生物的诊断。目前,已有全自动化的PCR检测试剂盒及仪器,如美国杜邦快立康公司的BAX病原菌检测系统。
(3)自动化传导法该法是通过仪器检测电导(或电阻抗)的改变来确定是否存在被检微生物。
2.大肠杆菌O157: H7
(1)鉴别性培养基法及显色培养基法 根据大肠杆菌O157: H7某些生化特征设计的一些选择性培养基,在这些培养基上E.coli O157: H7显示出特殊的颜色以与其他的大肠杆菌或杂菌区分开。目前,E.coLi O157: H7培养基有法国梅里埃公司的“O157 ID”和法国科玛嘉的“E.coli O157: H7显色培养基”。
(2)免疫学检测方法该法是利用抗原抗体反应建立起来的一系列检测方法。这类方法操作简便、灵敏度高,因此在对E.coli O157: H7的检测中得到最多的应用研究。
(3)分子生物学方法 该法包括DNA探针检测法和聚合酶链反应(PCR)技术。
3.金黄色葡萄球菌
(1)鉴别培养基法 以法国生物梅里埃公司的“Baird-Parker培养基”和科玛嘉的“金黄色葡萄球菌显色培养基”为典型代表。
(2)快速测试纸片法简称纸片法。典型代表是美国3M公司研制生产的Petrifilm金黄色葡萄球菌测试片,这是一种薄膜型的计数平板,是一种无需耗时准备培养基的快速检验系统。测试薄膜由检测片和反应片两部分组成。检测片含有改良的Baird-Parker培养基成分及冷水可溶性凝胶,对于金黄色葡萄球菌的生长具有很强的选择性,并能将其鉴定出来。反应片含有DNA、甲苯胺蓝及四唑显色剂,该显色剂有助于菌落的计数和确定葡萄球菌耐热核酸酶的存在。
金黄色葡萄球菌在测试片上显色为暗紫红色菌落,若检测片的菌落均呈暗紫红色,则无需再做进一步的确认。此即为确认的结果,测试即已完成。如果在测试片上有其他可疑的菌落出现,则可以使用金黄色葡萄球菌反应片来辨认是否为金黄色葡萄球菌。除了暗紫红色的菌落之外,若检测片出现其他颜色的菌落(黑色或蓝绿色)时,必须使用反应片。
金黄色葡萄球菌会产生脱氧核糖核酸酶(DNase),而此酶可与反应片上的显色剂反应形成粉红色环,故当确认反应片置入测试片中,金黄色葡萄球菌(少数情况下会是猪葡萄球菌及中间葡萄球菌)会形成粉红色环,其他种类的细菌则不会形成粉红色环。在葡萄球菌属中,呈凝集酶反应阳性的菌绝大多数是金黄色葡萄球菌、猪葡萄球菌与中间葡萄球菌。
(3)乳胶凝集试验法金黄色葡萄球菌表面存在A蛋白,具有种属特异性,该A蛋白能与人及多种哺乳动物的免疫球蛋白IgG的Fe段结合,因此可采用IgG包埋的乳胶颗粒,结合血浆纤维蛋白原与凝集因子的凝集反应,来检测金黄色葡萄球菌。作为免疫学方法之一,乳胶凝集试验在金黄色葡萄球菌的检测分析中,既可作为初筛,同时也是确认金黄色葡萄球菌的方法之一。
(4) DNA探针法该方法的原理是将已知的DNA片断上加上可识别的标记(如32p同位素标记、荧光素标记)制作成DNA探针,这样就可以用来检测样品是否具有其互补的序列。该法的典型代表是法国生物梅里埃公司的GEN-PROBE系统。大多数检测葡萄球菌的探针是针对肠毒素的。它们能同编码肠毒素有关的基因序列杂交,这类探针能检测肠毒素A、B、C和E。
(5)酶联免疫技术该法利用mini-Vidas全自动免疫分析仪。它是应用酶联免疫技术,用荧光分析技术通过固相吸附器,用已知抗体来捕捉目标生物体,然后以带荧光的酶联抗体再次结合,经充分冲洗,通过激发光源检测,即能自动读出发光的阳性标本,其优点是检测灵敏度高、速度快,可在48h的时间内快速筛选鉴定出金黄色葡萄球菌及金黄色葡萄球菌肠毒素。
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