大肠杆菌为革兰氏阴性菌，是人和其他温血动物肠道后段的常住菌，终生存在，一般不会对人机体造成伤害，但是在特殊情况下可引起机体的其他部位感染。致病性大肠杆菌中以O157∶H7对人致病性最强， 它属于EHEC（肠出血性大肠杆菌）， 像通常的致病菌一样产生细菌毒素， 可引发出血性结肠炎，出血性结肠炎可发展为溶血性尿毒综合征（HUS）和血小板减少性紫癜，严重者可发生死亡。随着人们对食品安全的广泛关注，大肠杆菌作为食源性疾病的主要致病菌之一，是病原检测的必要项目。食源性疾病病原检测技术是相关疾病预防与控制的关键。传统的检测方法主要是根据大肠杆菌的生化特征，进行前增菌、选择性增菌、镜检以及血清学验证。随着分子生物学技术的发展，相关病原快速检测方法也日新月异，目前主要包括常规PCR法、基因芯片法、实时荧光PCR方法、多重PCR法等，这些方法具有特异性强和灵敏度高的特点，但是需要较昂贵的仪器和专业的技术人员，试验成本也偏高，因此无法广泛推广应用。
环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一种新型的恒温核酸扩增技术，在等温条件下利用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域进行扩增反应，基因的扩增和产物的检测可一步完成。应用LAMP方法检测食品中的大肠杆菌时有报道，Hill等。利用LAMP方法快速检测出大肠杆菌。苑宁等利用LAMP方法检测牛肉中大肠杆菌的灵敏度为1.0 CFU/mL。杨文韬等[10]利用LAMP方法检测到牛乳中的大肠杆菌，在63℃下孵育60 min，最低检出限为547 CFU/mL。Harakudo等[11]利用LAMP方法在60 min内就能完成致病菌大肠杆菌的检测，灵敏度每个反应体系均大于0.7 CFU。但是在水中检测大肠杆菌的报道较少。刘莎等[12]利用LAMP方法对常规水质进行检测，灵敏度为每个反应体系10 CFU。另外，LAMP 扩增产物检测包括以下 3 种方式：（1）SYBR Green Ⅰ检测，在反应液中加入SYBR Green Ⅰ，可在紫外灯或日光下通过肉眼判定扩增结果，如果含有扩增产物，反应混合液变绿；反之，则混合液保持橙色；（2）副产物-焦磷酸镁的浊度检测，这种检测方式具有极高的特异性，使用浊度仪或肉眼观察就能够判断扩增与否；（3）琼脂糖电泳检测，因LAMP产物均为初始结构的整数倍，扩增产物经琼脂糖电泳后形成特异的梯状条带。
本研究利用大肠杆菌的malB基因设计LAMP特异引物，通过对反应温度、反应时间、dNTPs和甜菜碱浓度等条件进行优化，建立了快速检测饮用水中大肠杆菌的LAMP反应体系，为饮用水中重要致病菌的检测提供一种快速准确的技术手段。
1 材料与方法
1.1 试验材料
本研究所用菌种包括2株大肠杆菌目的菌株和金黄葡萄球菌等9株非目标菌株。
1.2 试剂与仪器
1.3 试验方法
1.3.1 LAMP引物设计与合成 根据GenBank中公布的大肠杆菌malB基因序列（EU118059.1），利用在线引物设计软件PrimerExplorer V4设计LAMP引物，4条引物分别为两条内引物（FIP/BIP）和两条外引物（F3/B3），
1.3.2 DNA模板的制备 将大肠杆菌菌株接种于YT培养基上37℃过夜培养，并将培养好的菌株按照TIANGEN细菌提取试剂盒说明书要求进行基因组DNA的提取。利用核酸定量测定仪测定提取基因组DNA的质量，-20℃保存备用。
1.3.3 LAMP技术检测大肠杆菌反应条件的优化 LAMP反应体系由外引物（F3/B3）、内引物（FIP/BIP）、BstDNA聚合酶、缓冲液、dNTPs、甜菜碱、ddH2O和核酸模板组成。对反应温度、反应时间、dNTPs浓度和甜菜碱等条件进行优化，确定最佳反应体系。反应温度在50.0～70.0℃之间，按照5℃梯度递增；反应时间在30～70 min之间按照10 min的反应梯度递增；dNTPs设置5个浓度，依次为0.05、0.1、0.2、0.3 mmol/L和0.4 mmol/L，在试验过程中保持等量模板和一个变量。在其他条件均优化好的前提下，分别加4 mol/L的甜菜碱0.25、0.5、0.75、1.0 μL和1.25 μL梯度进行试验，取5.0 μL LAMP扩增产物点样，经2%琼脂糖凝胶电泳检测，确定最佳的反应条件。
1.3.4 LAMP特异性试验 利用优化后的反应条件，对大肠杆菌目的菌株和金黄葡萄球菌等9株非目标菌株进行LAMP扩增，应用晒馊玖霞SYBR Green Ⅰ进行显色，在紫外光下观察检测扩增结果，并将产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，验证该方法的特异性。
1.3.5 LAMP灵敏度试验 取过夜培养的大肠杆菌菌液，然后按10倍浓度梯度稀释至10-8，原始菌液浓度为1.35×106 CFU/mL，37℃平板上过夜培养，测定纯培养的大肠杆菌的活菌数。同时将各稀释菌液利用TIANGEN细菌提取试剂盒提取DNA，取2.0 μL作为模板进行LAMP扩增，检测该方法的灵敏度。
1.3.6 LAMP检测大肠杆菌方法的验证 10种不同品牌的纯净水，经16S rDNA鉴定均为阴性样本，将每种纯净水各取1.5 mL分别加入500 μL大肠杆菌菌液，以不加任何目的菌液的纯净水为对照。所测样品采用TIANGEN细菌基因组试剂盒提取DNA，按照优化后LAMP反应体系和条件进行扩增，取5.0 μL进行琼脂糖凝胶电泳检测。同时根据反应之前加入的SYBR Green Ⅰ荧光染料在紫外灯下进行检测，若颜色呈现绿色则判读为阳性。
2 结果与分析
2.1 LAMP反应体系及反应条件的确定
根据试验条件参数的优化，大肠杆菌最佳的反应体系为：F3/B3（0.4 μmol/L）1.0 μL，FIP/BIP（2.4 μmol/L）3.0 μL，BstDNA 聚合酶（8 U/μL）1.0 μL，甜菜碱（4 mol/L） 0.75 μL，酶缓冲液2.5 μL，dNTPs（0.2 mmol/L）2.0 μL，DNA模板（10 ng/μL） 2.0 μL，补水至25 μL。通过梯度试验条件优化，最终确定大肠杆菌反应条件为60℃ 60 min，80℃ 5 min终止反应。
2.2 LAMP特异性验证
根据建立的LAMP反应体系和条件，对大肠杆菌和非目标菌（金黄葡萄球菌、化脓链球菌、苏云金芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、阴沟肠杆菌、赫氏埃希氏菌、停乳链球菌、嗜热乳酸链球菌、解淀粉芽孢杆菌）进行检测。经琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，大肠杆菌扩增出阶梯状条带，且清晰，其他非目标菌株均未扩增出条带，表明LAMP扩增对大肠杆菌具有较好的特异性。在反应之前加入SYBR Green Ⅰ荧光染料，等反应结束在紫外灯下观察，大肠杆菌组呈现绿色。
2.3 LAMP灵敏度试验
对大肠杆菌的纯培养菌液按10倍梯度进行稀释后分别提取基因组DNA，进行LAMP扩增，然后取5.0 μL扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳检测。可以看出，稀释到10-6时（大肠杆菌浓度为1.35 CFU/mL）仍能扩增出阶梯状条带，继续稀释则没有扩增条带。因此，LAMP扩增检测大肠杆菌灵敏度达到1.35 CFU/mL，证明LAMP技术具有较高的灵敏度。
2.4 供试样品检测
对供试样本按照优化的LAMP反应体系进行检测，取5.0 μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示，未添加大肠杆菌的纯净水样品均为阴性，加入大肠杆菌的供试样本检测均为阳性。紫外光下加入大肠杆菌的纯净水样品颜色为绿色，判读为阳性。
3 讨论与结论
受到致病性大肠杆菌污染的水会危害人体健康，能够引起中毒，导致呕吐、腹泻等症状。对于大肠杆菌的快速检测主要集中于以PCR为基础的分子检测方面，但相关PCR检测需要昂贵的设备，在基层检测上很难得到推广应用。本研究建立的LAMP扩增技术具有以下优势：
1）操作简便，避免污染。试验操作过程中可以一次性加入试剂、合成酶和SYBR Green Ⅰ染色剂，可以有效避免开盖过程中的交叉污染，避免造成假阳性影响检测结果，产生试验误差。
2）试验需要的仪器要求低，价格便宜。LAMP体系扩增反应保持在60℃左右，因此试验过程中只需要恒温PCR仪或恒温水浴锅即可完成反应，与荧光PCR扩增技术相比，不需要昂贵的检测设备。判定结果除可使用凝胶电泳法检测外，还可利用荧光染料在紫外灯下直接观测。
3）特异性强，灵敏度高。本研究中大肠杆菌的检测灵敏度为1.35 CFU/mL。
恒温介导扩增技术（LAMP）与其他分子生物学技术相比，具有较高的灵敏度。Yokoyama等也报道了LAMP扩增技术与PCR扩增相比具有较高灵敏度。Wang等利用MERT-LAMP检测技术检测沙门氏菌灵敏度达到125 fgDNA/反应。在不同的试验中检测灵敏度存在较大差别，可能与引物设计时选择的靶基因不同有关，也可能与反应体系中化学试剂、酶活性、金属离子浓度有关。目前，在食品致病菌方面报道的大肠杆菌靶基因有LT、VT、rfbE和malB，本研究选择的malB基因具有高度保守性，可以特异性地扩增出大肠杆菌。该方法可以对大肠杆菌进行有效的检测，为水中致病菌的检测提供广泛快速的技术手段。