双歧杆菌属（Bifidobacterium）是人类和动物（包括昆虫）正常肠道内微生物群主要成员之一现在已确认双歧杆菌是人体健康的重要标志之一[国内针对双歧杆菌曾多次召开微生态学术讨论会,在国际上, 1990 年在日本举行国际双歧杆菌专题讨论会, 对双歧杆菌的生理、生化、分类、作用机制及应用进行了广泛而深入的探索, 还探讨了双歧杆菌的生物屏障、抗肿瘤、抗衰老、抗感染等方面的功用。下面将对双歧杆菌的生物学特性及分类鉴定、生理功能、临床应用和其作为肿瘤基因载体菌方面的研究作一综述。
1. 双歧杆菌属的发现及生物学特性
双歧杆菌属是 1899 年由 Tissier H. 首先从母乳营养儿的粪便中分离出来，因其末端常常分叉,故命名为双歧杆菌,并于 1906 年试图把双歧杆菌的肉汤培养物移植到该菌数量减少的婴儿肠道中,用以提高对肠道疾病的抵抗力。双歧杆菌无芽孢、荚膜及鞭毛，无运动性触媒、硝酸盐还原、靛基质产生、及精氨酸水解均为阴性，是一类革兰氏阳性、多形态杆菌。
菌体形状呈 Y 字、V 字、弯曲状和棍棒状，形态受培养条件的影响，初代分离多呈分支或分歧状，继代培养后多呈现杆状或棒状。该菌初代分离时为专性的厌氧菌，但有的菌株在继代培养后可变成微需氧，CO2 对该菌有生长促进作用。双歧杆菌的菌落为 S 型，圆形凸起，周边整齐，在血平板上，菌落为白色或乳白色，其最适宜生长温度 36－38℃,最适 PH6.5～7.0。
2.双歧杆菌分子生物学分类鉴定
双歧杆菌的分类经历了一段漫长的历史, 它曾一度被列入乳酸杆菌属、放线菌属、棒状菌属及丙酸杆菌属，直到 1974 年才被正式确认为双歧杆菌属。当时双歧杆属包括 21 种，载入国际细菌分类专书《伯杰氏鉴定细菌学》(Bergeys Manual of Determinative Bacteridagy)第八版，现在已经增加到 32 个种。
近年由于科技的进步, 生物化学的研究深入, 遗传学方面的研究进展, 基因杂交、基因测序技术的出现, 使双歧杆菌属分类进入一个崭新的阶段。DNA 探针杂交技术出现的最早,1992 年 Ito 首先成功的制备了短双歧杆菌随机引物探针。为了解决克隆探针同位素标记污染问题，Tsutomu Kaneko 构建了地高辛标记的全染色体探针作为双歧杆菌属特异性探针。但这些方法因探针制备困难, 在实际应用上受到了很大限制。rRNA 是体的主要组成成分,编码它的 DNA 在基因组中具有中等拷贝数, rRNA 中含有保守区和可变区, 其中存储着大量的分类学信息。日本学者 Miyake 等测定了 21 种双歧杆菌 16s rRNA 全序列一起进行系统发育树分析, 构建了比较完善的双歧杆菌系统发育树。16s RNA 寡核苷酸探针制备简单、特异性好, 目前应用比较广泛。
基于双歧杆菌探针的种种缺隐, 人们开始研究 PCR 技术。PCR 引物是在 DNA 探针基础上设计的。 常规 PCR 程序对纯培养株展现出特异性,但有些菌株之间如婴儿双歧杆菌与蜜蜂双歧杆菌、长双歧杆菌与假长双歧杆菌存在交叉反应。荧光原位杂交 PCR 是选用 20 个碱基以内的寡核苷酸作为特异性探针, 与目的 DNA 进行杂交, 进行常规 PCR 扩增。 这种方法将杂交的高度特异性和 PCR 的高度灵敏度完美地结合起来, 有非常大的应用前景。分子标记是指可遗传并可检 DNA 序列, 它直接以 DNA 的形式出现, 在生物的各个生长期均可检测到, 不受季节、 环境的限制, 不存在表达与否的问题, 数量极多, 遍及整个基因组， 不需专门创造特殊的遗传材料。目前常用的分子标记技术有限制性片段长度多态性分析(RFLP)、随机扩增多态性 DNA (RAPD)以及简单序列重复程度多态性分析(微卫星 DNA 或 SSLP)。 近年来分子标记技术在双歧杆菌鉴定方面也有报道。 Roy 等采用 RA PD 技术对 5 种乳品双歧杆菌进行扩增, 得到重复、稳定的 RADP 指纹图谱, 通过与标准菌株比较, 可正确的鉴定出不同的双歧杆菌菌株。 RADP 是一种新的揭示基因组多态性的方法, 它已在种属特异性鉴定和基因水平分型中得到高度重视。 张丽娟等(1999) 对 20 株四种双歧杆菌做 PCR 指纹分析,可明显见到四种双歧杆菌所共有的三条带, 794bp、478bp、366bp 为属特异性带, 其它带为种特异带。RAPD 具有简便、快速、检出率高, 无需知道目的基因遗传背景, 引物通用, 重复性好等优点, 是一种分子水平上对细菌尤其是表型鉴定较难的厌氧菌属鉴定分型的好方法。
3．双歧杆菌的生理功能
3. 1 生物屏障和生物拮抗作用
双歧杆菌作为肠道中的优势菌，与其他正常菌群一起构成了阻止外来菌入侵的生理屏
障。双歧杆菌进入肠道后能否黏附于宿主肠道黏膜上皮细胞表面,形成稳定的菌群,是关系到
其是否能起到生物屏障和生物拮抗作用的重要前提.Matsumoto 等观察了不同类型的双歧杆菌、类杆菌、真杆菌、梭状芽胞杆菌、大肠埃希菌等对肠黏膜的黏附作用,发现双歧杆菌 L
KM512 菌株的黏附率是其他细菌的 2～100 倍。双歧杆菌黏附于肠黏膜上皮细胞上,通过自
身及产生的代谢产物排斥致病菌,在肠道中保持菌种优势,并与其他菌群相互作用,调整菌群间的关系,以保证肠道菌群最佳组合,并维持肠道功能的平衡。
关于双歧杆菌对肠道病原体生物拮抗作用的机理，目前认为有以下几种可能：
（1）通过双歧杆菌细胞壁的磷壁酸与肠黏膜上皮细胞特异性结合，从而占据肠粘膜表面, 形成与肠上皮细胞相连接的细菌生物膜, 起到占位性保护作用，从而阻止各种致病菌、条件致病菌的定值、入侵。叶桂安等报道，由蛋白质介导的双歧杆菌能特异地粘附于体外培养的肠上皮细胞。
（2）双歧杆菌能合成结合胆汁酸水解酶，可分解结合性胆酸为游离胆酸，游离态胆酸抑菌作用较结合态胆酸强，从而具有抑制细菌的生长作用。Grill 报道双歧杆菌能产生结合胆酸水解酶，使结合胆酸游离，更有效地抑制致病菌的生长，但缺乏胆酸 7α-脱羟基酶，因而避免二级胆汁酸生成，而后者是病原体生长繁殖所需要的。
（3）双歧杆菌能分泌胞外糖苷酶， 降解肠黏膜上皮细胞上与致病菌和内毒素结合受体的复杂多糖， 从而阻止致病菌对肠黏膜细胞的侵袭。Falk 研究发现双歧杆菌能够产生细胞外α-,β-糖苷酶，这些酶可以降解肠道黏蛋白低聚糖和乳酸系列Ⅰ型糖鞘脂，阻止细菌侵袭。
（4）在代谢过程中经由特殊途径的双歧杆菌支路产生有机酸，如乙酸、乳酸和甲酸等，能显著降低环境中的 pH 值和氧化还原
电势(Eh)抑制致病菌繁殖，从而形成肠道的化学保护屏障，抑制非正常菌群如痢疾杆菌、 伤寒杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌和真菌的生长及其有害代谢物的产生。 其中，乙酸的抑菌作用最强，乳酸次之。
（5）调节和协调其他肠道菌群，促进肠蠕动，使致病菌粘附到肠黏膜上皮的机会减少。
（6）产生类似细菌素的蛋白质,有一定的杀菌作用。国外学者报道动物双歧杆菌虽然不能完全阻止白色念珠菌病的发生， 但是能够明显降低念珠菌病的发病率和缓解
病情。此外双歧杆菌还能产生 H2O2 ,从而激活机体产生过氧化氢酶,抑制和杀灭革兰阴性菌,
如志贺菌和沙门菌等。
3. 2 增强免疫功能、延缓机体衰老
双歧杆菌的免疫调节作用是重要的,对超敏反应、免疫低下、免疫排斥及口服免疫耐受性都起重要作用。 它能通过菌体抗原及代谢产物刺激肠黏膜淋巴结,激活免疫活性细胞, 提高自然杀伤细胞和巨噬细胞活性,产生特异性抗体和致敏淋巴细胞,调节机体免疫应答。激活巨噬细胞的β－半乳糖苷酶活性,加强和促进其吞噬作用。人体内腐生菌的代谢产物如吲哚、甲酸、氨等,如不及时清除,可导致肝功能、循环系统以及神经系统功能异常,双歧杆菌能抑制腐生菌的生长,从而有效地防止了有毒物质的产生；它还能以氨为氮源在肠道内合成氨基酸和尿素,从而降低了血氨浓度,提高体内蛋白质积蓄。双歧杆菌菌体成分或代谢产物具有抗胆固醇功能,能明显减少肠管对胆固醇的吸收,同时促进胆固醇转变为胆酸盐,从而加快其排出体外,对延缓机体衰老有积极作用。蓝景刚给小鼠腹腔注射双歧杆菌发现小鼠脾 N K、LA K 细胞活性增强, 腹腔局部巨噬细胞来源的细胞因子 IL- 1、TN F、IL - 6 活性增强。Madsen 等将冻干的长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌和短双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种和植物乳杆菌及唾液链球菌嗜热亚种制成益生菌复合物。 每天管饲小鼠 4 周后发现益生菌复合物能使小鼠的大肠生理功能和肠上皮紧密连接的完整性趋于正常,黏膜分泌 TNF 和干扰素减少， 组织学病变改善。蔡访勤等人在实验中证实给小鼠腹腔注射双歧杆菌, 原位激活后, 由肝脏分离的非实质细胞(NPC) 对 YAC-1、P815、L 929 三株瘤细胞有明显的细胞毒作用, 同时胸腺细胞和脾细胞对 Con A 刺激的增殖反应明显增强, 脾细胞产生的 TNF 活性也增强。王立生等研究表明双歧杆菌具有免疫赋活作用, 能激活机体免疫系统中的巨噬细胞、 N K 细胞以及 B淋巴细胞, 提高机体的特异性及非特异性免疫功能。Marin ML 报道各种双歧杆菌都能直接与巨噬细胞相互作用, 增加 IL - 6 和α- TNF 细胞因子的产量。蒋虹等报道双歧杆菌可以产生一些耐热的抗菌物质, 可以耐受 100 ℃ 30 min 抑制致病菌的生长, 提高局部和全身的防御功能。
3. 3 营养作用
双歧杆菌体内含有大量的消化酶， 能消化一些宿主机体内依靠本身的酶系不能消化的营养物质，从而促进体内营养物质的吸收。 同时，双歧杆菌直接或间接地参与维生素如硫胺素、核黄素、尼克酸、吡哆醇、泛酸、叶酸和维生素 B12 等的合成、吸收和利用，并能以氨为氮源在肠道内合成氨基酸和尿素， 从而有效降低血氨浓度， 提高体内蛋白质积蓄。 另外，双歧杆菌通过抑制某些维生素分解菌来保障体内维生素的供应，如抑制分解维生素 B1 的芽孢杆菌，通过改变肠道内微生物构成，保证机体对维生素的需要。双歧杆菌在肠内发酵后能产生乳酸和醋酸,可降低环境 pH 值,亦有利于二价铁、钙及维生素 D 的吸收。双歧杆菌发酵乳糖产生的半乳糖是构成神经系统中脑苷脂的成分, 与婴儿出生后脑的迅速生长有密切关系。双歧杆菌还可以改善蛋白质的代谢,如产生的蛋白磷酸酶可将乳汁中α－酪蛋白降解, 提高蛋白质消化吸收率。有些人肠道中缺乏β-半乳糖苷酶, 致使对半乳糖消化不良, 服用丽株肠乐(双歧杆菌活菌制剂), 能够明显改善乳糖消化不良症状。Jenkins DJ 等报道双歧杆菌可利用结肠部位不被消化的寡糖产生短链脂肪酸如 L -乳酸。
3. 4 抑制肿瘤的作用
双歧杆菌的抗肿瘤作用机理除了公认的增强人体的免疫功能, 非特异性增强肿瘤局部反应, 改善肿瘤病人淋巴细胞亚群分布和促进细胞免疫功能等方面的免疫调节作用外, 据报道还能减少肠内致癌物的形成, 同时使某些诱发癌症的酶失活, 诱发癌症凋亡基因的表达。
双歧杆菌的抗肿瘤作用包括活菌体、 灭菌体及细胞壁骨架的抗肿瘤作用。 其作用机制主要是激活机体的免疫统中的巨噬细胞,促进其分泌具有抗肿瘤活性的细胞因子,如 IL-G 和 TNF－α等间接发挥抑制肿瘤的作用。另外,双歧杆菌菌体细胞壁的肽聚糖、磷壁酸和多糖都有抗肿瘤作用。
蒋虹等发现双歧杆菌脂磷壁酸 （LTA） 作用于大肠癌 LoVo 细胞后能增强 LAK 对该细胞的识别和杀伤，并认为其机制可能在于 LTA 通过上调 LoVo 细胞上 ICAM-1 的表达，增强了LAK 对其的识别和结合。张金洁等发现双歧杆菌及其细胞壁肽聚糖（WPG）通过刺激巨噬细胞产生一些活性因子(IL-G、 INF-α)而间接发挥抑瘤作用。Sekine 等以皮下接种了 Meth A纤维肉瘤的小鼠作为动物模型研究了婴儿型双歧杆菌细胞壁的3种成分即完整肽聚糖(wholepeptidoglycan．WPG)、超声处理过的 WPG 以及细胞壁骨架对 Meth A 纤维内瘤的影响，结果证实将上述任一种成分与瘤细胞混合接种到 BALB／C 小鼠皮下， 均能明显抑制肿瘤的生长。若将上述成份分别注射于荷瘤鼠的瘤体内，抑瘤率可分别达到 70% 、40% 及 2O%。
实验证明,双歧杆菌的抗肿瘤作用是肯定的,但只是实验肿瘤学方面的成果,怎样把这些成果应用于临床,还要进行更多的细致的研究工作。
4．双歧杆菌的临床应用现状
4．1 双歧杆菌对肠道疾病的防治
据我国卫生部材料统计,每年约 8. 36 亿次患急性感染性腹泻,其< 5 岁小儿约 2. 09 亿人次,是发病最多的年龄段。康宏宇等采用丽珠肠乐(双歧杆菌) 治疗小儿腹泻,治疗组 50 例,对照组 45 例,治疗组服用丽珠肠乐胶囊 1 粒,2 次/ d ,对照组服用乳酸菌素片 1 片,2 次/ d ,6天为 1 个疗程,结果是治疗组总有效率为 98. 0 %,对照组为 55. 6 %,两组差异有统计学意义( P< 0. 01) ;施荣杰采用丽珠肠乐治疗急性腹泻,治疗组62 例,对照组58 例,治疗组服用丽珠肠乐胶囊 2 粒,3 次/ d ,对照组服用庆大霉素片 8 万单位,3 次/ d ,5 天为 1 个疗程,结果是治疗组总有效率为 91. 93 %,对照组有效率为 79. 31 %,两组之间差异有统计学意义( P < 0. 05) ;张捷等采用金双歧治疗肠易激综合征,按“罗马标准Ⅰ”的诊断标准确诊为该病患者142 例,口服金双歧 2. 0 g ,2 次/ d ,2 周为 1 个疗程,观察期间记录治疗前后每天的包括腹痛、腹胀、排便频率和和大便性状及不良反应。结果是治疗 1 周,总有效率为 65. 4 %,治疗 2 周,总有效率为85. 2 %,无 1 例发生不良反应,疗效确切,患者依从性好,值得推广应用。
4．2 双歧杆菌在控制内毒素血症中的作用
内毒素是革兰阴性菌最外层的结构, 是一种大分子脂多糖, 在感染或使用抗生素导致肠道菌群失调的情况下, 受抑制的肠道细菌大量繁殖, 产生大量内毒素, 导致内毒素血症。人体肠道中内毒素 90% 以上来源于肠腔内革兰阴性杆菌的释放与裂解, 肠道内毒素池的变化与 G- 菌消长有密切关系。双歧杆菌可以改善肠道 PH 值, 抑制有害菌的产生, 同时竞争性结合肠粘膜位点, 阻止致病菌定值、入侵及细菌易位, 显著缩小内毒素池。曾有多篇报道双歧杆菌通过调节肠道菌群减少内毒素生成或吸收, 从而使血中内毒素水平下降, 减轻对其它脏器的损害。
4．3 辅助治疗肝病
我国乙型肝炎病毒携带者达 1. 3 亿人,每年乙型肝炎的发病人数达 1 千 3 百万。尽管目前干扰素、拉米夫定等抗病毒药物在临床已得到广泛的应用,但慢性病毒性肝炎发展为肝硬化、慢性重型肝炎的势头并未因此得到有效的遏制。李强等采用金双歧活菌片(主要成分为长双歧杆菌) 对乙肝肝硬化患者进行疗效观察。 治疗组和对照组各 43 例,治疗方法为治疗组在普通支持疗法的基础上加用金双歧片 12 片/ d ,对照组仅用普通支持疗法,2 个月为 1 个疗程。结果表明,治疗组中腹胀、腹泻、便秘、纳差、乏力症状的缓解率及 AL T 复常率、T－BiL 复常率均明显高于对照组;治疗组中血氨、Child－Pugh 分数均明显低于对照组,金双歧活菌片治疗乙肝肝硬化安全、有效,其疗效优于对照组。肠道菌群紊乱与肝功能损害程度密切相关,正确使用微生态制剂可以维护肝硬化患者的肠道微生态平衡,减少内毒素的产生和吸收,对稳定肝病患者的病情起着积极的作用。
4．4 临床抗肿瘤研究
双歧杆菌不仅在动物体内具有一定的抗肿瘤作用， 许多学者在临床方面也作了很多有益的探索。Kubota 等分析了 4O 侧大肠腺瘤及 56 侧大肠癌患者的肠道苗群．结果发现腺瘤及癌患者肠道内双歧杆菌的数量显著降低， 而致病性的梭状芽胞杆菌则增多． 且随着腺瘤不典型增生程度的加重．双歧杆菌的数量也进行性下降，大肠癌患者的数量最低，提示大肠腺瘤及癌的发生与演进与双歧杆菌数量的减少具有一定的关联，另一方面 Ishihara 等将双歧杆菌用于临床肿瘤的治疗也取得了一定的效果．他们将双歧杆菌的 WPG、1L-2、TNF-α、IFN－γ及 OK-432 等生物反应调节剂注射到恶性黑色寨瘤患者的皮肤转移灶内． 结果表明 WPG 能使肿瘤转移灶缩小．效果与 IFN－γ相当，并且无任何毒副作用。Korshunov 等则调查了 39例患有宫颈上皮内瘤样病变(CIN)的生育期妇女的阴道菌群，也发现双歧杆菌的数量显著下降。使用促进该菌生长的药物,Solco-Trichovac 能使部分患者的 CIN 减轻甚至消退，说明维持阴道内双歧杆菌的正常数量对预防和治疗宫颈癌均具有重要意。
5．双歧杆菌作为基因载体在肿瘤治疗中的应用
肿瘤治疗依然是当前人类急需解决一个重大课题，目前肿瘤虽有多种治疗手段,但主要还是以手术为主、放疗、化疗和生物治疗为辅的综合治疗,大多数肿瘤的治疗效果不甚理想。随着分子生物学和重组 DNA 技术的产生和发展，肿瘤的基因治疗为肿瘤的治疗带来了新的曙光。基因治疗广义上的定义是指将某种遗传物质转移到患者细胞内,使其在体内发挥作用,以达到治疗疾病的目的， 基因治疗的方法已成为全球许多医药学和生物化学实验室的研究重点。
基因治疗概述
基因治疗(genetherapy) 是新近发展起来的一项新技术,经典的基因治疗指在基因水平上对遗传缺陷进行纠正,它主要是向靶细胞或组织中引入外源基因 DNA 或 RNA 片段,以纠正或补偿基因的缺陷,关闭或抑制异常表达的基因,从而达到治疗的目的。通常包括基因置换、基因修正、基因修饰、基因失活等 34。现在基因治疗已从对单基因缺陷性遗传病的基因替代治疗,拓展至对致病基因的修正和基因增强治疗,以及采用外源调理性细胞因子基因、核酶
类及反义核酸类基因药物进行治疗。
基因治疗的靶细胞可分为两大类:体细胞和生殖细胞。将遗传物质引入人的体细胞进行基因治疗的方法称为体细胞基因治疗( somatic cell genetherapy);以生殖细胞为对象的基因治疗称为生殖细胞基因治疗(germ cell genetherapy)。 上世纪 80 年代初,Anderson 首先阐述了基因治疗的概况。 1990 年美国国立卫生研究院的 Blease 等成功地进行了世界上首例临床基因治疗,即腺苷脱氨酶(adenosinede－aminase, ADA) 缺陷病的人体基因治疗。1991 年我国首例基因治疗 B 型血友病也获得成功。近年来,这一领域的研究取得了重大进展,基因治疗作为一种全新的疾病治疗手段,将在一定程度上改变人类疾病治疗的历史进程。
基因治疗的方法
基因治疗常用方法有两种,即体内疗法(invivo) 和体外疗法(exvivo) 。 体内疗法是将外源-基因导入受体体内有关的器官组织和细胞内,以达到治疗目的。这是一种简便易行的方法,如肌肉注射、静脉注射、器官内灌输、皮下包埋等,但其缺点是基因转染率较低。目前研究和应用较多的还是体外疗法,即先在体外将外源基因导入载体细胞,然后将基因转染后的细胞回输给受者,使携有外源基因的载体细胞在体内表达治疗产物,以达到治疗目的。
肿瘤基因治疗载体的特点和类型
在基因治疗中一个非常关键的技术问题就是载体的选择， 理想的治疗载体应具备以下特点:
①易于进入靶细胞;
②在特异细胞或组织中达到有规律、充分及持续的外源基因表达;
③安全有效并具有选择性;
④易于大量生产。目前应用于基因治疗研究的基因转移载体主要分为病毒载体和非病毒载体两大类。病毒性载体包括反转录病毒载体、腺病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺病毒相关病毒载体、痘病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体、仙台病毒载体、杂交病毒载体等，病毒性载体其优点是转染效率高,但其存在免疫原性、细胞毒作用、携带外源基因的大小受限和病毒滴度不易提高等问题， 其安全性问题始终存在。 非病毒性载体包括真核细胞表达质粒载体、非生物性的聚合物载体、聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、壳聚糖、明胶基系统、阳离子缩氨酸、人工染色体、活菌载体等，非病毒性载体虽然转染效率较低,但是其突出的优点就是安全、制备简单和巨大的携带外源基因的容量。
现在国内外学者正在集中研究和解决基因治疗的载体问题,主要是利用各种技术提高载体的靶向性和转染效率,解决外源基因在体内的表达调控和有效性,这些都是目前国内外学者进行载体研究的热点。
双歧杆菌作为肿瘤基因治疗载体研究细菌具有一定的抗肿瘤作用,而且某些细菌具有肿瘤靶向作用,它们可以在肿瘤组织内复制、增生,而在正常组织内被清除。目前已经被应用于肿瘤治疗的菌包括，鼠伤寒沙门氏菌、梭状芽胞杆菌、以及双歧杆菌。在这些被用来作为肿瘤基因治疗的菌中，双歧杆菌作宿主有益的生理菌并具有在肿瘤低氧坏死区定植繁殖的特点而备受关注。
在过去几年中，构建双歧杆菌-大肠杆菌穿梭载体已见报道，如基于长双歧杆菌衍生质粒 pMB1 构建的穿梭载体 pRM2、pNC7、pDG7 和基于 B. longum KJ 衍生质粒 pKJ50 构建的 pBKJ50F 和 pBKJ50R。 但是这些穿梭载体不能在双歧杆菌中表达外源基因。 到目前为止，已经有长双歧杆菌、短双歧杆菌、婴儿型双歧杆菌、动物型双歧杆菌以及青春型双歧杆菌被成功转导了穿梭质粒。本实验室前期研究了含 endostatin 的大肠杆菌表达质粒 pBV222 在双歧杆菌中表达 Endostatin 和抗肿瘤效果， 发现质粒 pBV222 能在双歧杆菌中表达 Endostatin ，但发现 pBV222 相对于双歧杆菌来说是外源 DNA，很容易就被其 DNA 酶降解，所以不能稳定存在于双歧杆菌中。因此，在基础上，本实验室又构建了 pBV22210-endostatin 质粒，该质粒以 pBV222 为构建基础，插入双歧杆菌敏感的氯霉素抗性基因(Cmr)以及来自长双歧杆菌的质粒 pMB1，并将具有抑制血管生长的内皮抑素基因克隆入该质粒载体，结果显示该质粒能够在长双歧杆菌中稳定存在并表达目的蛋白，此外，抗肿瘤活性研究结果显示含pBV22210-endostatin 质粒的长双歧杆菌可显著抑制小鼠肝癌实体瘤的生长。 Park MS.等构建了 pBES16PR-CHOL 质粒，该质粒以 16S rRNA 的启动子序列作为其启动子，并将胆固醇氧化酶结构基因科隆入质粒中， 研究发现转导了该质粒的长双歧杆菌， 其细胞提取液具有胆固醇氧化酶活性。Reyes Escogido ML 构建了 PL-10 质粒，该质粒能够在双歧杆菌和大肠杆菌中可溶性表达 rhIL-10 蛋白。此外 Hidaka 等将胞嘧啶脱氨酶基因克隆到 pAV001-HU-eCD.穿梭质粒中。 并将该质粒转染了 B. breve I-53-8w短双歧杆菌和 B. longum aE-194b, B. longumbs-601,and B. longum 105A 三种长双歧杆菌，实验结果表明均能够表达胞嘧啶脱氨酶蛋白，其中以短双歧杆菌的表达量最高，并且该质粒能够在该菌中稳定存在。
6. 问题及展望
目前，对双歧杆菌的研究和医学应用巳进入了一个全新的时期。如果说，双歧杆菌研究
应用的第一阶段是发现双歧杆菌在微生态平衡中的重要作用并应用于保健和一些慢性疾患的辅助治疗。 第二阶段是证实双歧杆菌的非特异性免疫增强和调节作用并应用于抗肿瘤辅助治疗。今天，双歧杆菌的研究应用巳进入第三阶段即作为抗肿瘤基因治疗的导向载体。理论上，凡对实体瘤有治疗作用的基因，诸如血管生长抑制因子的基因，肿瘤自杀基因，校正和修复突变的癌基因的基因片段， 具有杀伤瘤细胞的淋巴因子的编码基因等， 均可用双歧杆菌作为导向载体。 双歧杆菌很可能为恶性肿瘤的治疗提供新的契机。 当务之急是要对双歧杆菌的基因组成，遗传稳定性等作进一步深入的研究。