1 材料与方法
1. 1 实验材料
1. 1. 1 菌种
ATCC菌种 S tap hylococcus ep ider mids ( 表皮葡萄球菌)AT CC26069; Stap hylococcus x ylosus ( 木糖葡 萄球菌)ATCC29971; S tap hylococcus albus( 白色葡萄球菌)1. 184; S tap hylococcus inter medius( 中间葡萄球菌)1109;Escherichia coli( 大肠杆菌)AT CC25922; E . coli( 大肠杆菌)AT CC35401; Salmonella typ himurium( 伤寒杆
菌)AT CC14028; Salmonella ty phimurium ( 伤 寒杆 菌)50071; Shigella dy senteriae ( 痢疾 志贺 氏菌)1. 1869; Strep tococcus hemolytis( 甲型溶血性链球菌)32205; Strep tococcus hemoly tis( 乙型溶血性链球菌)32204; L isteria monocy togenes( 单核增生李斯特氏菌)ATCC35152; L isteria monocytogenes( 单核增生李斯特氏菌)AT CC35152; Bacillus cereus( 蜡样芽孢杆菌)AT CC11778; Yersinia enterocolitica ( 小肠结肠炎耶尔森氏菌)52001; Vibrio p ar ahaemolyticus ( 副溶血性弧菌)20001; K lebsiella p neumoniae( 肺炎克雷伯氏菌)ATCC46114; K lebsiella p neumoniae( 肺炎克雷伯氏菌)AT CC46117.菌种接种于营养肉汤培养基中, 36 , 振荡过夜培养至菌悬液浓度达到 109CFU/ mL.
1. 1. 2 培养基
营养肉汤培养基、营养琼脂培养基,
1. 1. 3 乳粉
乳粉均购自当地超市.
1. 1. 4 化学试剂
10 倍 PCR buffer, dNT Ps, T aKaRa Taq, DNA M arker DL2000 购自大连宝生物工程公司; 引物( 正向引物, 反向引物)
1. 1. 5 实验仪器
PCR 仪为 Whatman T Gradient 基因扩增仪, 电泳仪为北京市六一厂生产的DXY33A 型电泳仪, UVIpro 凝胶成像系统.
1. 2 方 法
1. 2. 1 乳粉人工污染
在人工污染肺炎克雷伯氏菌前, 该乳粉按标准方法检测证实不含有肺炎克雷伯氏菌. 将肺炎克雷伯氏菌人工污染到乳粉中, 使样品中肺炎克雷伯氏菌达到 10- 1~ 107CFU/ mL, 直接提取人工污染的乳粉中的肺炎克雷伯氏菌 DNA.
1. 2. 2 DNA 提取
将乳粉与灭菌水混合, 质量浓度为 10 g / mL, 取 10 mL 还原乳以 500 r/ min 离心 10 min. 吸取上清液加入另一灭菌离心管中以 14 000 r/ min 离心 10 min, 沉淀物用 500 L 生理盐水悬浮, 加入 0. 25 倍体积的乙酸乙酯, 振荡器混匀 2 min, 然后以 17 000 r/ min 离心 10 min. 去掉上清液, 沉淀物用 20 L 生理盐水悬浮, 加入直径 2. 00 mm 滤膜片, 56 干燥, 干燥后的滤膜片加入 0. 1 g/ mL SDS 溶液 200L 煮沸10 min, 用滤膜专用缓冲液洗涤 2 次, 然后再用 TE 缓冲液洗涤 2 次, 56 干燥后即可作为 PCR 反应的模板.
1. 2. 3 PCR 法检测肺炎克雷伯氏菌
1. 2. 3. 1 PCR 引物 引物序列通过 Oligo6. 0 设计并在 NCBI 上进行 BLAST, 筛选出特异性的引物
1) , 由大连宝生物公司合成. 从金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、痢疾志贺氏菌、肠炎沙门氏菌、甲型溶血性链球菌、乙型溶血性链球菌、单核增生李斯特氏菌、蜡样芽孢杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、副溶血性弧菌、肺炎克雷伯氏菌中提取 DNA 进行 PCR 扩增, 检测引物特异性
1. 2. 3. 2 PCR 反应体系 总反应体系 50 L, 包括 5 L 10 倍 PCRbuffer, 4 L dNTPs 混合物, 0. 5 L40 mol正向引物, 0. 5L 40 mol反向引物, 0. 25 L( 5 U / L) T aq, 模板 2 L, 水 37. 75 L.
1. 2. 3. 3 PCR 扩增程序条件的优化 PCR 反应采用冷启动. 94 预变性 5 min; 94 变性 45 s、退火( 56 5) 60 s、延伸 72 45 s, 35 个循环; 最后 72 延伸 5 min, 4 保存.
1. 2. 3. 4 电泳检测 取 1 L 的 6 倍 Loading Buffer 和 5L PCR 产物混合后, 置于 20 g/ L 琼脂糖凝胶上进行电泳, 利用凝胶成像系统观察结果并成像.
1. 2. 3. 5 PCR 产物鉴定 大连宝生物工程公司对 PCR 扩增产物进行 DNA 测序.
2 结果与分析
2. 1 PCR 引物特异性的检测
本研究通过引物设计软件结合肺炎克雷伯氏菌的 IT S 特异性基因序列进行特异性引物的设计, 并通过美国国立生物信息中心的在线 BLAST 进行比对, 筛选出特异性的引物对, 同时对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、痢疾志贺氏菌、肠炎沙门氏菌、甲型溶血性链球菌、乙型溶血性链球菌、单核增生李斯特氏菌、蜡样芽孢杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、副溶血性弧菌、肺炎克雷伯氏菌中提取 DNA 进行 PCR 扩增, 电泳检测结果证实设计的引物特异性可以满足检测要求
2. 2 PCR 反应条件的优化
为了保证乳粉中肺炎克雷伯氏菌检测的高效, 对 PCR 反应的退火温度进行了优化, 最终筛选出 59. 2 为最佳退火温度 .
2. 3 PCR 检测结果
本研究通过FTA 滤膜法直接从含有10 CFU/ mL 肺炎克雷伯氏菌的人工污染乳粉中提取了肺炎克雷伯氏菌的 DNA. 利用 PCR 扩增技术, 成功地检测出了人工污染的乳粉中的肺炎克雷伯氏菌. 可知乳粉的检出限是 10 CFU/ mL, 检测结果
2. 4 PCR 产物鉴定
为保证检测结果的准确性, 对扩增产物进行了纯化, 交由大连宝生物工程公司对 PCR 扩增产物进行DNA 测序, 测序结果见表 2, 可知 PCR 扩增产物 DNA 序列与文献报道的靶基因序列的同源性达100 % , 从而证实 PCR 扩增产物为目的扩增产物
3 讨 论
早期的研究人员利用 PCR 从脱脂乳中检测出 105CFU / mL 的肺炎克雷伯氏菌, 该检测的灵敏度( 105CFU / mL) 较低, 可能是提取的 DNA 中含有 PCR 反应抑制因子或是 PCR 反应条件没有最优化所致. Brakstad 等[ 7] 利用 PCR 扩增肺炎克雷伯氏菌的 nuc 基因来检测营养肉汤培养基中的肺炎克雷伯氏菌, 灵敏度达到 10 CFU/ mL, 但从血样品中提取肺炎克雷伯氏菌的 DNA 进行扩增时, 其灵敏度降为 103CFU / mL. 这可能是从血样品提取的 DNA 中含有 PCR 反应抑制因子所致.食品的成分极为复杂, 有些成分为 PCR 反应抑制因子, 可导致 PCR 检测灵敏度的下降. 食品中的脂肪成分被认为是降低 PCR 检测灵敏度的主要因素之一[ 8]. M clauchlin 等[ 9] 报道从奶酪中提取的 DNA 中含有PCR 反应抑制因子, 影响 PCR 检测. Lantz 等[ 10] 利用多重 PCR 技术检测猪肉样品中小肠结肠炎耶尔森氏菌, 该方法对样品进行增菌后, 使检测灵敏度达到 102CFU/ mL. Jinneman 等[ 11] 利用多重PCR 扩增技术检测原料奶、牛肉等样品中 E . coli O157H7 的 DNA, 也是利用增菌来提高检测的灵敏度. 虽然增菌提高了检测灵敏度, 但也延长了检测时间, 一般可延长 12~ 24 h. 本研究无需增菌, 直接从污染肺炎克雷伯氏菌的乳品中提取 DNA, 利用 PCR 技术对肺炎克雷伯氏菌的 ITS 基因进行扩增来检测该菌. 该方法可直接从人工污染的乳粉中检测出肺炎克雷伯氏菌, 最低检出限为 10 CFU/ mL, 整个检测过程可在 6 h 内完成, 比目前普遍采用的先增菌再进行 PCR 检测的方法缩短了 12~ 24 h, 其检测灵敏度远远高于导致食物中毒所需的肺炎克雷伯氏菌数[ 12]. 该方法能快速、有效地检测乳及乳制品中肺炎克雷伯氏菌, 而且还可以用来监测 HACCP 的危害,
分析关键控制点, 以监控在牛奶的收集过程以及产品加工后肺炎克雷伯氏菌的污染情况！