中国微生物菌种查询网分离肿瘤干细胞的主要思路与分离成体干细胞的思路类似，包括根据特殊的表面林记分子进行分选和SP细胞分离，其中依赖干细胞表面标志分离的可供选择的分选系统为免疫磁珠分选系统和荧光激活细胞分选（fluorescence-activated cell sorting, FACS）技术。
（一）免疫磁珠一AC133十脑肿瘤干细胞分选
【实验用品】
(1) 材料 抗人AC133磁珠及MS分离柱。
(2）设备 磁性细胞分选器（MACS:)或全自动磁性细胞分选仪（AutoMACS）表面酒精消毒，提前30min放入超净台中紫外线消毒；一次性无菌移液管，15ml和50m1离心管等。
【试剂配制】
(1) 组织保存液的配制TC199培养基，l00ml；青霉素（10000U/ml), 4ml；链霉素(10000μg/ml)，4m1 。
用0. 22μm滤器过滤除菌。4℃保存。
(2) MACS缓冲液的配制PBS, 200m1；牛血清白蛋白，lg; EDTA-Na2, 0. 159g。
调节pH值至7.2，用0. 22μm滤器过滤除菌。4℃保存。
【实验方案】
1．开始前准备
脑肿瘤手术样本，取材后在保存液中4℃保存，尽快进行下一步实验。
2．磁珠标记
(1) 按实体肿瘤细胞培养章节中的方法制备出脑肿瘤的单细胞悬液。
(2) 300g离心6min。
(3）磁性标记细胞 去除上清液，拍散沉淀的细胞团，用预冷的缓冲液重悬细胞，调整细胞浓度为1×107个／80μl缓冲液（少于1×107个细胞时也用80μl缓冲液重悬），每80μl细胞悬液中加入20μl抗人AC133磁珠。注意：标记过程要快速，保持冰上操作，以防止抗体非特异性结合。
(4）轻轻混匀，4℃孵育20min。
(5）加入10倍或20倍标记容积的缓冲液，300g离心10min。
(6）完全去除上清液。每108个细胞用500μl缓冲液重悬。
3．磁珠分离
(1) 将无菌分离柱从包装中取出，固定在MACS磁场内。注意分离柱的无菌。
(2) 分离柱下放一收集管。
(3) 先用500μl无气泡的缓冲液润洗分离柱，使其流过分离柱，但勿使其干燥，去除流出物，更换收集管，准备分离。
(4）缓慢将标记的细胞悬液加入分离柱，收集流出物，作为阴性部分。
(5) 待细胞悬液全部进入分离柱后，立即加入缓冲液冲洗。每次用0. 5ml缓冲液洗涤分离柱，共三次。注意：每次加缓冲液的时机必须是前面的液体刚全部进入分离柱，但柱子尚未干燥前。
(6）待液体流尽后，将分离柱移出磁场，加入lml缓冲液于分离柱内，加压洗脱，收集洗脱的阳性细胞。
(7) 细胞纯度的检测：用FITC标记的AC133抗体标记细胞，4℃孵育30min，离心洗涤两次，用0. 5ml生理盐水重悬，上机检侧。细胞纯度可达95％一99％。
(8) 对分离获得的脑肿瘤干细胞进行生物学鉴定。
【注意事项】
(1) 免疫磁珠细胞分选具有快速、纯度好、产量高、对细胞活力损伤小等优点。
(2）磁珠标记策略有直接标记和Pul接标记。间接磁性细胞标记时，选择未结合抗体、生物素化抗体或者荧光素标记抗体作为一抗标记细胞，再使用抗免疫球蛋白微珠、抗生物素或链霉亲和素微珠、抗荧光素微珠作为二抗磁性标记细胞。间接标记主要适用于没有直标磁珠时，或实验需要用几种抗体的混合物同时分选或去除多种类型的细胞，或使用自备抗体或者配体的磁珠分选，此外间接标记有放大作用，因此可在磁性分选抗原表达弱的目的细胞时使用。
(3）磁珠分选策略分为阳性分选和阴性分选。阳性分选策略是用免疫磁珠直接从细胞混合物中分离靶细胞的方法，适用于分选标志明确的肿瘤干细胞。阴性分选策略是用免疫磁珠去除无关细胞，使靶细胞得以纯化的方法，适用于缺乏针对目的细胞的特异性抗体，把已知的成熟细胞组分去除后，达到富集肿瘤干细胞的目的。在分选阳性比例很低的肿瘤干细胞时，还经常联合使用阳性分选和阴性分选，以得到高纯度的肿瘤干细胞。
【实验结果及分析】
(1) 用FITC标记的抗AC133抗体对分选得到的细胞进行标记，流式细胞鉴定阳性比例。
(2) 对分离获得的脑肿瘤干细胞进行生物学鉴定，以明确其是否具有普通肿瘤细胞所不具备的干细胞特征，即自我更新和分化能力。
① 一般生物学特征鉴定主要观察肿瘤干细胞的形态，生长特征及核型分析。肿瘤干细胞的形态多为圆形，大小不一。与普通肿瘤细胞相比，肿瘤干细胞具有倍增时间较短、细胞生长密度增加、细胞核分裂指数较高，并且具有无限增殖能力、细胞侵袭能力较强等特征。细胞周期分析，大部分肿瘤干细胞处于G0期。
② 体外克隆形成能力或肿瘤球形成能力鉴定这是肿瘤干细胞鉴定的一个重要指标。
a．克隆形成实验：在克隆形成实验中，将分选的阴性及阳性细胞分别以低浓度移植到
96孔培养板，每孔植入100-200个细胞，大约7d后观察其各自克隆形成情况，由此证明分选的细胞形成克隆的能力。
b．集落形成实验：白血病干细胞可进行集落形成实验，将分离的阴性及阳性细胞分别接种到合适的集落培养基中进行培养，一般14d后观察集落（>20个细胞）形成数量。与普通组细胞所形成的集落相比，白血病干细胞能够形成小的分散的集落，并且很少发生红系细胞分化。
c. 实体瘤干细胞的肿瘤球形成实验：实体瘤干细胞在体外培养时常常形成肿瘤球。将分离得到的肿瘤干细胞重悬于合适的培养基中，进行倍比稀释，并接种到96孔培养板，最终细胞稀释的范围从200-1个细胞／孔。培养7d后，对总的肿瘤球形成数目进行计算，并计算比例。与分离的阴性细胞相比，肿瘤干细胞形成肿瘤球能力更强，得到肿瘤球的比例也越高。
③ 分化能力鉴定肿瘤干细胞的一个重要特征就是具有分化能力。
a．体外分化能力的鉴定：可对分离的肿瘤干细胞和在合适培养基中继续培养一段时间后的肿瘤细胞进行干细胞相关和分化相关的分子检测。可采用免疫组化，流式细胞仪分析以及RT-PCR的手段进行研究。
b．体内移植实验：体内实验是对肿瘤干细胞自我更新与增殖分化能力的直接验证。将肿瘤干细胞注射到严重免疫缺陷的实验小鼠体内（例如一次性注射100个、200个、500个、1000个细胞）观察其体内成瘤的情况和免疫组织化学检测，由此推断目的细胞形成肿瘤组织和增殖分化出不同成熟细胞的能力。肿瘤干细胞移植到NOD/SCID鼠内，可以在受体鼠内连续传代，分离出的肿瘤干细胞二次移植时仍能产生具有异质性癌细胞的肿瘤，并可多次重复，得到的肿瘤与原代肿瘤一致。
④ 肿瘤干细胞相关分子表达的检测肿瘤干细胞和成体干细胞之凤有很多的相关性，肿瘤干细胞也能检测到与干细胞自我更新和分化相关的基因表达，已经有报道脑肿瘤干细胞除了表达CD133，还具有Sox-2, musashi-1, Bmi-1,巢蛋白（nestin), melk, PSP,磷酸丝氨酸磷酸化酶等神经干细胞和其他干细胞的基因特征。
（二）流式细胞仪法分选CD34+ CD38- Thy-1一的急性粒细胞白血病干细胞
【实验用品】
(1）材料 淋巴细胞分离液（Ficoll-hypaque，密度为1. 077g/ml)。
(2）设备 流式细胞分选仪，提前消毒；一次性无菌移液管，15ml和50ml离心管等。
【试剂配制】
(1）血制品保存液的配制TC199, 100ml；肝素，4000U；青霉素（10000U/ml),4m1；链霉素（10000pg/ml)，4m1 。
用0. 22μm滤器过滤除菌，每份5ml分装，4℃保存，1个月内使用。
(2）流式洗液的配制1 × HBSS, 200m1；胎牛血清，4g。
用0. 22μm滤器过滤除菌，4℃保存，1个月内使用。
【实验方案】
1．开始前准备
(1) AML患者的外周血可在4℃保存，24h内分离。
(2) D-Hanks液或生理盐水，室温。
2．实验操作
(1) 取AML患者的外周血5m1，与5ml无菌保存液混匀，立即送实验室分离单个核细胞。
(2）加10m1室温D-Hanks液或生理盐水稀释外周血。
(3）取Ficoll-hypagμe（有成品供应，密度为1. 077g/ml±0. 001g/ml) 3.4m1，放入15ml离心管中。
(4) 将稀释后的外周血沿试管壁缓缓加入，使稀释血液重叠于分层液上，稀释的血液与分离液体积比例约为1，1-2，1。注意：一定要细心，动作要轻，避免冲散分层液面或与分层液混合而影响分离结果。
(5）用水平离心机以300g离心力，室温离心20min 。
(6) 离心后管内容物分为三层，上层为血浆（内含血小板），中间层为分层液，底层为红细胞和多核细胞。在上、中层液体界面处可见到乳白色混浊的单个细胞层，呈白膜状。用毛细吸管轻轻插到白膜层，沿试管壁边缘吸取界面层单个核细胞，移入50m1试管中。
(7）加入5倍以上体积D-Hanks液，混匀，200g离心10min。
(8）吸弃上清液，轻轻拍散沉淀的细胞团，加20m1 D-Hanks液，200g离心10min 。
(9) 步骤（8)重复一次。
(10) 吸弃上清液，轻轻拍散沉淀的细胞团，加20m1流式洗液，200g离心10min。
(11) 将细胞置于冰上，用流式洗液按106个/100μ的细胞浓度重悬。
(12) 细胞染色：加入Cy5标记的抗人CD34抗体，PE标记的抗人Thy-1抗体和FITC标记的抗人CD38抗体，抗体浓度根据产品说明书的要求确定。
(13）冰上避光放置30min。
(14) 200g离心10min。
(15）去除上清液，轻轻拍散细胞团，加l0.ml流式洗液，200g离心10min。
(16) 步骤(15)重复一次。
(17) 用适当体积（106个细胞／0. 5ml)的流式洗液重悬细胞，按终浓度2μg/ml加入碘化丙锭(PI)，置于冰上，避光，待上机。
(18）流式细胞仪分选，根据PI摄取量去除死细胞后，根据荧光强度分选CD34+CD38- Thy-1一细胞亚群，分选出的细胞用含有50%FCS的IMDM培养基重悬。
(19）分析纯度，通常要求在95％以上。将分选得到的细胞接种培养或进行相关生物学检测。
(20）根据分选结果CD34+ CD38-Thy一细胞比例可以得到肿瘤干细胞的比例。
(21）肿瘤干细胞分离后，需要进行一系列的生物学鉴定，以确定分离得到的这部分细胞具有普通肿瘤细胞所不具备的自我更新和分化能力。
【注意事项】
(1)分离外周血单个核细胞吸取白膜层时，应避免吸出过多的上清液导致血小板污染，或过多的分层液导致细胞获得率下降。本法分离单个核细胞纯度可达95%，细胞获得率可达80％以上，得率的高低与骨髓液的稀释、白膜层的吸取及室温有关，室温超过25℃时会
影响细胞获得率。
(2)整个流式细胞分选前的细胞染色过程中，注意冰上操作，以最大限度地保持细胞活性；整个过程注意避光；若分离得到的细胞还要进行无菌培养，在整个操作过程中要注意无菌。
【实验结果及分析】
对分选获得的细胞进行细胞计数，并进行肿瘤干细胞生物学鉴定。
（三）SP细胞的分选
SP(side population）细胞又称为边缘群细胞。用结合DNA的荧光染料Hoechst 33342处理细胞，利用肿瘤干细胞可将染料泵出细胞的性质，经过荧光活化细胞分选系统fluo-rescence activated cell sorting, FACS）的分析，将不被染色或低染色的肿瘤干细胞筛选出来。已经有报道从肿瘤细胞系和实体瘤中都能分离出SP细胞，并且这群细胞具有肿瘤干细胞的特征。以乳腺癌为例，介绍分离SP细胞的方法。
【实验用品】
流式细胞分选仪，提前消毒；一次性无菌移液管，15m1和50m1离心管等。
【试剂配制】
(1) 1000×Hoechst 33342储存液（5mg/ml，-20℃长期保存）。
(2) 1000×PI储存液（2mg/ml，-20℃长期保存）。
(3）组织保存液的配制TC199培养基，100m1；青霉素（10000U/ml) , 4m1;链霉素(10000μg/ml)，4m1。
用0. 22μm滤器过滤除菌。4℃保存，1个月内使用。
(4）流式洗液的配制1×HBSS, 200m1；胎牛血清， 4g。
用0. 22μm滤器过滤除菌，4℃保存，1个月内使用。
【实验方案】
1．开始前准备
乳腺癌手术样本，浸泡在样品保存液中，分离前4℃保存，最长时间不超过24h。
2．实验操作
(1) 按实体肿瘤细胞培养章节的方法分离乳腺癌单细胞悬液，按1×107个／ml的细胞浓度重悬在1×HBSS中。
(2）按照5μg/ml的终浓度逐滴加入Hoechst 33342，轻轻混匀。
(3) 37℃温箱中孵育90min 。
(4) 200g离心10min。
(5）去除上清液，轻轻拍散沉淀的细胞团。用流式洗液重悬细胞，细胞浓度调整为106个细胞／0. 5m1。
(6) 按照2μg/ml的终浓度滴加PI染料，置于冰上，避光，待上机。
(7) 从乳腺癌组织中分离SP细胞的阳性率较低，一般在1％左右。
【注意事项】
(1) 乳腺癌手术样本取材时要注意材料越新鲜，肿瘤干细胞分离成功的概率越大，一般样本必须在外科手术1h之内得到。手术或活检切取的样本应尽早浸入无血清的培养基（用M199, RPM11640等基础培养基均可，可适当添加青霉素或链霉素，减少污染）中保鲜。此外应注意取未经治疗和没有坏死的标本进行分离为宜。
(2) 流式分选前，取出一小部分细胞进行计数，观察细胞是否仍保持单细胞，若观察到有细胞成团，用40μm尼龙网过滤，避免成团的细胞影响流式细胞仪分选。