嗜酸乳杆菌的生长曲线和耐酸你的测定结果-ATCC菌种
中国微生物菌种查询网 / 2018-09-28 11:36:32
嗜酸乳杆菌不仅在胃中，它还是人体小肠内的主要益生菌。 在胃中能存活的致病菌的胃部是个小型"消毒车间"，这是由于胃液具有很强的酸性。嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属，革兰氏阳性杆菌，杆的末端呈圆形，主要存在小肠中，释放乳酸，乙酸和一些对有害菌起作用的抗菌素，但是抑菌作用比较弱。
由于嗜酸乳杆菌多以发酵乳制品作为载体，而发酵过程中产生的乙酸和乳酸使得乳制品本身具有较低的pH 值 （pH 值为4.5～5.0）；另外，在食用这些发酵乳制品的时候还要经过胃液的低酸性环境。胃液pH 值因饮食结构不同波动很大，通常约为3.0。人每天可以分泌大约2.5L 胃液，空腹时胃液的pH 为1.5，在进食后逐渐上升到3.0～5.0。食物在胃中停留的时间为1～2h。以上这些酸胁迫的存在，会影响嗜酸乳杆菌的存活率，进而影响其在肠道中的进一步定植和生理保健功效的发挥。因而，研究嗜酸乳杆菌对模拟胃酸pH 值的耐受性，判断该菌能否顺利过胃而起到益生作用，就具有重要的现实意义。
材料和方法
1、材料
菌株来源 ：嗜酸乳杆菌 （Lactobacillus acidophilus），代号为ATCC4356；La-IM1、La-IM2 和La-IM3 分离自内蒙古传统发酵乳制品。
仪器设备 ：紫外分光光度计、光学显微镜 （OLMPUS ）、梅特勒—托利多Delta320pH 计、电热手提式压力蒸汽灭菌器、恒温培养箱、超净工作台等。
培养基 ：RS培养基[9]:5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L牛肉膏，20g/L葡萄糖，2g/L K HPO ，2g/L柠檬酸二铵，5g/L 乙酸钠，0.58g/L MgSO .7H2O ，0.25g/L MnSO .4H2O, 调pH6.2～6.4，固体需加15g/L琼脂粉，121℃灭菌15min。
2、方法
菌种的活化与分纯
用接种环挑取少量冷冻干燥保藏的菌粉，接种于液体MRS 培养基中37℃，24h培养，连续传代两次进行活化；将活化后的菌种于MRS 固体培养基上划线培养，37℃，48h 培养；挑取半个单菌落染色镜检，如果镜检未发现杂菌，则用接种环挑取另外半个单菌落接种于液体MRS 培养基中培养并保存备用；如果镜检发现杂菌，则用接种环挑取单菌落于MRS 固体培养基上划线培养，再镜检，直至分纯。
株菌酸耐受性的实验
将4 株嗜酸乳杆菌以3% 的接种量接种于MRS 液体培养基中进行传代一次。用盐酸调节MRS 液体培养基的pH 值为2.5，吸取4.5mL 于4 个试管中，置于高压灭菌锅内进行121℃、15min灭菌。按照 10%的添加量吸取500 μL菌液分别加入到4个试管中作用3h。作用结束后，将试管在漩涡混匀器上进行震荡混匀，平板涂布进行活菌计数。
嗜酸乳杆菌La-IM2生长曲线的测定
将嗜酸乳杆菌La-IM2 按3％的接种量，接种到装有300mL液体培养基的锥形瓶中，37℃进行培养。每隔2h在无菌超静工作台中取出20mL 用于测OD600 和pH 值，直至24h，然后绘制生长曲线。
嗜酸乳杆菌La-IM2在不同pH值条件下的酸耐受性实验
用盐酸调节PBS缓冲液的pH值分别为 1.5、2.5、3.5、4.5、7，然后将嗜酸乳杆菌La-IM2 按 10％的接种量接种于以上pH 值的PBS 缓冲液中，在37℃下进行作用，作用时间分别为1.5h和3h，随后将试管在漩涡混匀器上进行震荡混匀，平板涂布进行活菌计数。
活菌计数方法
每个样品取3 个平行，用PBS 缓冲液 （pH 7）逐步稀释5个梯度。以MRS 固体培养基为计数培养基，于37℃培养48～72h后平板计数[10]，选择平板上菌落数在30～300个菌落的平板，统计菌落数，最后求取平均值。
结果与讨论
株嗜酸乳杆菌的耐酸力评价
4株嗜酸乳杆菌菌株ATCC4356、La-IM1、La-IM2和La-IM3在pH2.5 的PBS 缓冲液中作用3h 后的活菌数分别为：2.92 ×108、1.2 ×108、1.13 ×109和 1.18 ×108 CFU/mL，存活率分别为：73.92%、70.91%、102.72%和83.69%。活菌数均大于108CFU/mL，存活率均高于60%，证明4 株嗜酸乳杆菌在pH 为2.5 的条件下酸耐受性较好，其中菌株La-IM2 的酸耐受性最高。 另外，菌株La-IM2 的存活率超过100%，原因可能是该菌株来自于开菲尔粒，而开菲尔粒的发酵酸度很高，该菌株经过长期低pH 值的酸适应后，菌株的酸耐受性进一步增加，因而变得较另外3株嗜酸乳杆菌菌株更为耐酸；其次，本实验采用MRS 液体培养基调节pH 值作为菌株的酸耐受基质，使得较耐酸的该菌株可以在其中继续生长，菌液浓度进一步升高，存活率超过 100%。
嗜酸乳杆菌La-IM2 的生长曲线的测定结果
嗜酸乳杆菌La-IM2的生长曲线可知，在2h的时候该菌即可进入对数期生长，在10h后开始进入稳定期。随着培养时间的延长，培养基中的pH值逐渐降低，24h后降低为3.6，这说明该菌生长速率较快，产酸能力较强，适合于作益生菌菌株。
嗜酸乳杆菌La-IM2在不同pH 条件下的酸耐受性评价结果
嗜酸乳杆菌La-IM2在pH 1.5、pH 2.5、pH 3.5、pH 4.5、pH 7.2条件下作用1.5h后的活菌数分别为1.42 ×106、2.96 ×108、5.45 ×108、3.85 ×108、3.95×108CFU/mL；在3h后的活菌数分别为0、2.92 ×108、4.80 ×108、4.15 ×108、3.60 ×108 CFU/mL。该菌在pH 1.5 时培养3h后几乎没有活菌的存在，而培养 1.5h后的活菌数仍然在 106CFU/mL 以上，且其他作用条件下的活菌数均在108CFU/mL 以上，证明该菌株酸耐受性非常好。
通过模拟胃酸pH 值条件下的酸耐受性实验，证明嗜酸乳杆菌可以以较高的活菌数顺利过胃，进而起到益生菌的作用（国际乳品联合会IDF推荐益生菌浓度＞ 107CFU/g 时能顺利到达小肠并发挥益生作用）。但是，由于时间原因，本实验只对嗜酸乳杆菌La-IM2 在模拟胃酸pH 条件下的耐受性进行了评价，没有对其在模拟胃液环境下的存活率进行测定，因而不能完全说明该菌可以以较高的活菌数过胃。还需要进一步实验，以测定其在模拟胃液环境下的活菌数，最终证实其是否具有益生功效。
结 论
（1）4株嗜酸乳杆菌ATCC4356、La-IM1、La-IM2和La-IM3 在pH2.5 ，3h 条件下的酸耐受性较高，活菌数均大于108CFU/mL，存活率均高于60%。其中菌株La-IM2 的酸耐受性最高，活菌数达到 1.13 ×109 CFU/mL。
（2）嗜酸乳杆菌La-IM2满足典型的对数生长曲线规律，在2h 时该菌进入对数期生长，10h后进入稳定期。说明该菌生长速率很快，产酸能力较强，适合于用作益生菌菌株。
（3）嗜酸乳杆菌La-IM2虽然在pH1.5 时作用3 小时后活菌数为0，但是在其他作用条件下的活菌数均在 108CFU/mL以上，证明该菌株在模拟胃酸pH 条件下的耐受性较好，可以通过胃液的低酸性环境进而发挥益生功效。
本研究以内蒙古传统发酵制品中分离鉴定的嗜酸乳杆菌和ATCC 标准菌株为供试菌种，进行了耐酸和耐胆盐的嗜酸乳杆菌的筛选，并对筛选菌株生长特性进行了研究，为嗜酸乳杆菌发酵食品的生产应用提供参考。