一，细胞培养基的选择
（1）根据细胞特点、蛋白表达及病毒特点和培养方式选择细胞培养基
商售工业用细胞培养基主要是干粉培养基，常用的培养基主要包括199、MEM、RPMI-1640、DMEM、DMEM/F12等系列，根据细胞的特性及工业化的生产需求，开发或生产的同一系列的细胞培养基在成份上也有一定的变化，如MEM细胞培养基有含Earle's平衡盐的类型，也有含Hanks'平衡盐的类型；依据除菌方式又可分为高压灭菌型和过滤除菌型；还有含非必需氨基酸的类型，及是否含有酚红等；DMEM培养基分为高糖型和低糖型，据此结合实际培养的细胞特点、产品特点及生产工艺等进行选择和优化，最终选择的培养基需要达到以下目标：
1.提高细胞密度和细胞活力；
2.提高单位体积培养液中病毒量或抗体表达量，提高生产效率；
3.降低动物来源成份，简化纯化成本，提高生物制品的安全性。
不同的细胞株甚至同一细胞株在不同的培养条件下都有着不同的营养需求，细胞作为病毒等繁殖的宿主，为细胞株选用合适的培养基，使细胞保持快速增殖和高活率状态，才能够提高生物制品的产率。在选用合适的细胞培养基时可根据以下几种方法进行：
可从细胞系最初建系用培养基，也可从细胞的来源处获得，细胞库（如ATCC、ECACC）可以提供常用细胞系所用培养基的信息。但该种细胞培养基通常选择的是最基础的培养基。
1.还可用多种细胞培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据试验结果选择最佳培养基，这是最客观的方法，但比较繁锁。
2.也可根据本实验室惯用的细胞培养基，许多培养基可以适合于多种细胞，通过几种培养基的选择测试进行挑选，亦可参考一些经验（见表6-1），缩小选择的范围。
3.针对细胞特点及培养工艺需要。
培养细胞的目的是使其表达生产相应的目的物，因此，在满足细胞生长增殖的基础上，细胞培养基的开发还应满足病毒等在细胞中的高表达及性能稳定性。同一株细胞可以作为几种生物制品的生产平台（如上表中所列）、同一病毒液可在几种宿主细胞中表达，因此，选择最优化的宿主细胞及最高产品表达量是生物制品厂家追求的一个目标，而相应细胞培养基的正确选择是促使目标实现的一个重要影响因素。LONZA公司2005年【12】研究结果表明，同一细胞株，采用优化后的限定化学成份细胞培养基与传统的合成细胞培养基相比，蛋白表达量提高了9.6倍，从该结果可以看到细胞培养基的选择和优化对于提高产物表达量的重要性。
生产工艺的革新或改进是提高生产效率、降低生产成本的一个有效途径，相应细胞培养基的支持显得较为重要。如由转瓶培养转换为生物反应器培养时，传统的合成细胞培养基较难满足生物反应器中细胞的高密度生长、抗剪切力、降低表面张力等需要，则需要更换相应的悬浮培养用细胞培养基满足上述需求。在有血清悬浮培养转至无血清悬浮培养时，缺少了血清的保护和促增殖作用，相应无血清培养基的支撑显得更为重要。
随着细胞培养技术及基因工程技术的发展，细胞株的改造和驯化技术提高，高表达细胞株或是悬浮细胞株（贴壁细胞悬浮化培养等）的构建、驯化，如细胞由贴壁培养状态向悬浮培养状态转换时，或是在有血清悬浮培养转至无血清悬浮培养时，细胞的代谢状况可能发生改变，传统用细胞培养基可能不能适应改造后或是驯化后细胞株的生长增殖需求，相应个性化细胞培养基的支撑显得更为重要。相应个性化细胞培养基的支撑显得更为重要。这些个性化细胞培养基或是直接来自细胞培养基生产厂家的革新、或是与使用者共同开发定制的专业化细胞培养基。
（2）选择高品质的细胞培养基
细胞培养基作为原材料直接影响生物制品的质量。无论是国产细胞培养基还是进口细胞培养基，由于国内目前还无明确的法律法规来规范细胞培养基的产、销过程，各企业执行各自的生产工艺及产品配方，由于信息的不对称，细胞培养基生产企业存在的诸多问题，尤其是安全性问题并不能被用户所了解。生物制品生产企业需筛选真正符合生物制品原材料质量要求的培养基，从源头上控制好生物制品的安全风险，需建立基本的产品检验标准，尤其在没有统一法规、行规的条件之下，只能通过挑选合格的供应商、自身建立一套质量检验体系，对每批产品进行检验等确保培养基的质量。
（3）从经济性、安全性角度选择合适的细胞培养基
随着生物制品安全性要求的提高，细胞培养基作为生物制品的一个重要原材料，直接影响其产品的质量和安全性。当前，基于人、蓄安全性角度考虑，国外许多法规要求采用不含动物组份的细胞培养基，无动物来源成份的无血清细胞培养基将是生物制品企业选择的趋势所在。
除满足安全性需求外，选择细胞培养基时价格也是不得不考虑的一个因素。工业化通常直接购买供应商的干粉细胞培养基，有些培养基可能需要添加谷氨酰胺，大部分基础合成细胞培养基中需要添加一些血清。随着对生物制品安全性要求的提高，并满足生物制品体外生产时需要去除动物蛋白的要求，针对一些连续细胞系，设计了个性化的低血清细胞培养基及无血清细胞培养基，虽然这些培养基的价格较为昂贵，但相比血清给后期纯化及产品质量带来的影响，这些培养基生产的产品质量和安全性明显较高，相应产品的市场竞争力增强、市场占有率提升，企业的最终的生产效益提高。
（4）供应商的选择
选择细胞培养基的同时也需考核、选择供应商。
目前，国内细胞培养基行业管理存在缺失现象，国内细胞培养基行业没有统一的生产质量管理规范。生物制品企业除自身建立一套质量检验体系外，挑选合格的细胞培养基供应商是进行原材料质量控制的另一种重要的方法。选择供应商时可通过对比细胞培养基生产企业在硬件和软件上的情况和差距，对细胞培养基的原材料、生产过程、生产环境、生产用设备、应用性检测、安全性检测等方面检查并评估供应商的生产、质控能力。
国产与进口细胞培养基的生产及销售渠道可能会有一定差别，进口产品供货周期有一定限制，在国产和进口培养基均能够满足生物制品厂家要求的时候，国产细胞培养基相应是较好的选择，原因主要包括两个方面，一方面国产细胞培养基在价格上存在优势，生产同样的产品，与国内细胞培养基厂家相比，技术水平和可信度较高的国外细胞培养基厂家通常整体规模较大，相应的产品生产及运营费用较高，导致产品价格昂贵；另一方面，细胞培养基使用厂家可直接考核国内供应商，易于使用厂家控制细胞培养基的质量，并更易获得产品性能相关的技术支持及售后技术服务。
二，细胞培养基的配制和灭菌
细胞培养基的种类不同，其使用上可能会有一定的差异，因此正确的配制细胞培养基是使其被充分利用的前提。
（1）培养基配制准备工作
物品准备、器皿清洁（物理、化学及生物清洁）符合GMP要求，最终目的是保证细胞培养基的纯度：避免混入抑制物、有毒物质及减少微生物污染的机会。
配制前需要确保设备及仪器正常运转，通常所用的设备或仪器主要包括：
1) 超净工作间或超净工作台：可根据自身条件或建立设施完备的万级、千级、百级等超净工作环境。
2) 烤箱：烘烤玻璃器皿、去除热原。
3) 高压蒸汽灭菌锅
4) 恒温培养箱：用于检测过滤后的细胞培养基中是否还含有细菌的检测。
5) 过滤器：不锈钢滤器或一次性膜过滤器。
6) 仪器：天平，pH 计，渗透压仪，正压、负压蠕动泵或吸引器，纯水设备。
由于使用或配制量不同，在设备或仪器的规格上可能会有出入，但需确保所有的设备和仪器需按GMP等相关规定进行验证，其中，配液用水管路出水口所出水每天需进行检测；不锈钢过滤器每次使用前和使用后需进行无菌验证，验证合格方可使用。
（2）干粉细胞培养基的配制方式及注意事项
在细胞培养基配制过程中，不同的培养基其溶解性可能有一定的差别，培养基配制过程中血清、碳酸氢钠及抗生素等的添加时间和用量、pH和渗透压的测定及酸碱度是否需要调节等，都可能影响最终细胞培养基性能的发挥。
a,配制常规过滤除菌粉末细胞培养基
1) 配制用水：通常选择最新制备的超纯水器过滤出的去热原（细菌内毒素<0.25EU/m）培养基用水（TOC< 10μg/L或者是10mg/L，电阻率：18.2MΩ（25℃））。最好现用现制备，隔夜储存用水（非无菌）的细菌内毒素及电导率等升高，影响细胞的增殖和产品的质量；
2) 培养基粉剂的称量：小量采用天平称量，要求准确；大量采用市售大包装，配制时可以根据说明；
3) 粉剂溶解：溶解充分，观察有无颗粒，颜色改变情况等；
4) 过滤前约半个小时（根据配制量可调）按使用说明添加NaHCO3，充分溶解；
5) 测定pH，根据需要用1mol / L 氢氧化钠溶液或 1mol /L盐酸溶液来调节pH。过滤后的pH将会有所增长；
6) 定容，检测渗透压；
7) 尽快过滤、分装，封好瓶口，避免漏气，2~8℃保存；
8) 采用一次性滤器时滤后检查滤膜，有无漏、裂、是否很脏或是有未溶解物；采用不锈钢滤器（内置可反复用的除菌滤芯）需进行滤器的完成性检测；
9) 过滤前、中、后三段采样进行无菌检测，同时，留取样品置于37℃培养，至该批培养基用完；
10) 完整记录整个过程每一个步骤，便于追溯。
新购细胞培养基或是新批次的细胞培养基，需小剂量配制，进行细胞适应试验，结果验证可用后，方可进行大规模配制。
b,配制可高压灭菌粉末细胞培养基
1) 其配制用水及配制粉剂的称取、及配制程序基本同过滤型培养基配制方法。溶解后高压，通常在121℃、15psi下灭菌15分钟。
2) 待细胞培养液冷却至室温，按一定比例加入无菌的谷氨酰胺溶液、无菌7.5％（w/v）碳酸氢钠溶液，加注射用水（水温20℃～30℃）至规定体积，混匀。
3) 如果必要，用1mol / L 氢氧化钠溶液或 1mol /L盐酸溶液调pH至所需值。
4) 溶液应在2℃－8℃下避光保存。
目前国内工业化用细胞培养基主要为干粉型。考虑水质量对细胞培养液的影响以及使用方便，国外实验室和部分工业生物制药企业开始使用一次性袋子包装的液体细胞培养液。鉴于目前运输成本，我们国内生物制药企业基本都采用干粉型细胞培养基，配制培养基要注意以下几个共同问题：
1) 培养基配制用水的品质控制非常重要。
2) 在配制或使用过程中应注意配置说明，不可随意浓缩，因为不同成份的溶解性不同，如叶酸在浓缩的储存液中会产生沉淀。
3) 产品说明书中都注明干粉细胞培养基中不包含的成份，常见的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES、酚红等。这些成份中有些是必须加，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些则要根据实验需要来决定。
4) 配制时要保证充分溶解，NaHCO3、谷氨酰胺等物质都要在培养基完全溶解之后才能添加。
5) 所用器皿应十分洁净。
6) 配制好的细胞培养基应马上过滤，无菌保存于2℃－8℃。
c,不同细胞培养基的除菌方式及注意事项
细胞培养基灭菌的方式分为高压灭菌和膜过滤除菌，不同的培养基由于其营养成份不同，灭菌方式也可能不同。
绝大多数细胞培养基不适宜高压灭菌。因为高压灭菌易破坏细胞培养基中的一些成份，如某些维生素等，因此，在通常的高压灭菌型细胞培养基中，配方中的维生素种类与过滤型培养基相比较少，对于细胞生长不可或缺的谷氨酰胺等，需待高压后补充到培养基中。在高压过程中，灭菌用器皿的选择应注意避免蒸发或是污染。在大规模工业化生产中，可以采用短时超高温处理的方法进行流水线式的灭菌，能够提高自动化生产效率，降低成本。
膜过滤除菌是当前较为常用及便捷的一种方法，常采用0.2μm孔径的滤膜，部份采用0.1μm孔径，与高压过滤方式相比，虽然滤膜具有使用期限且价格较高，但对细胞培养基的营养成份破坏性较小。
d,不同细胞培养基存储过程中的注意事项
通常液体细胞培养基避免- 20 ℃冻存，因为解冻时可能会有营养成份析出，影响培养效果；正常情况下于2℃~8℃避光保存，使用前从冰箱取出，放入室温进行平衡。通常的液体培养基有效期是6个月到12个月。液体细胞培养基尽量避免长期贮存，其中的谷氨酰胺会随着储存时间的延长而慢慢分解，如果细胞生长不良，可考虑检测培养基中的谷氨酰胺含量确定是否再补加谷氨酰胺。市售商业化液体细胞培养基有具体的有效期，对于使用干粉细胞培养基自行配制成液体以后，也应低温（2℃~8℃）贮存，除培养基中如谷氨酰胺易降解之外，培养基中的其他成份随着温度的升高也可能会发生降解或是析出。
在国内传统的生物制品生产过程中，配制的细胞培养基过滤后用转瓶进行分装，为防止液体过滤及分装时可能存在的污染性问题，常采用配制后于37℃搁置一段时间（7~14天），无菌方敢使用，但是对比试验显示，低温贮存的细胞培养基培养细胞的效果好于37℃存贮，通常对于过滤设备的验证合格后，过滤过程中间隔取样进行无菌验证即可；并且大批量长时间的高温贮存除可能对营养成份造成降解外，场地及高温的保持也造成了生产成本的提高。目前，对于一些较大规模的生物制品厂家，已经实现管道化配制、使用，污染的安全性明显降低。
工业化生产中通常采购干粉细胞培养基，与液体培养基相比，存储方便且价格便宜，干粉细胞培养也应长期贮存在2~8℃，尤其是对于一些营养丰富的低血清和无血清细胞培养基，成份复杂且含量较高，有些成分的溶解性较低，生产过程中采用特殊的加工工艺提高其溶解性的同时，如果长期的高温或极端低温条件，也有可能改变其理化性质，在购买或是使用过程中，须严格按照产品说明书进行存储。
三，细胞培养基使用过程中常见问题分析
（1）细胞培养基的缓冲系统选择及pH变化问题
由于大多数细胞适宜的pH为7.0~7.4，偏离此范围可能对细胞生长将产生有害的影响。但各种细胞对pH的要求也不完全相同，原代培养的细胞一般对pH变动耐受力差，无限细胞系耐受力强。因此，原代培养时，培养液中的缓冲系统就显得较为重要。一般的细胞培养基采用的都是平衡盐系统，但不同的培养基或是同一系列的培养基所用平衡盐系统不同，如199系列培养基、MEM系列培养基均有Hanks′系统的培养基及Earle′s系统的培养基。但是有些培养基不是上述常规的平衡盐系统，例如RPMI1640培养基、F12培养基。MEM低血清培养基的平衡盐系统也不是常规的平衡盐系统，该平衡盐系统的缓冲能力强于常规平衡盐系统的缓冲能力，选择合适的缓冲系统具有重要的作用。
在配制细胞培养液时，新配制的培养基在经过0.10um或0.22um滤膜过滤时，溶液的pH会向上浮动0.2左右。
细胞培养过程中pH值下降产生的原因较多。在细胞生长非常快时，pH值通常下降得很快，此时可以通过及时传代、提高传代比例或降低血清量等方法进行解决。此外，培养瓶盖拧得过紧、NaHCO3缓冲系统缓冲能力不够、培养液中盐浓度不正确、细菌、酵母或真菌污染等也能导致pH值通常下降得很快。这时，可以通过以下几种方法解决：
1) 按培养液中NaHCO3浓度增加或减少培养箱内CO2浓度，NaHCO3含量在2.0g/L到3.7g/L之间时对应的CO2浓度为5％到10％；
2) 改用不依赖CO2培养液；
3) 松开瓶盖1/4 圈。在培养液加HEPES缓冲液至10到25mM终浓度；
4) 在CO2培养环境中改用基于Earle′s盐配制的培养液，在大气培养环境中培养改用Hanks′盐配制的培养液；
5) 如果是污染造成的则丢弃培养物或用抗生素除菌。
（2）细胞培养基常用几种重要的添加成份及使用过程中应注意的问题
酚红在细胞培养基中用作pH值的指示剂，一般情况下，可以通过酚红的指示作用判断培养基的pH值，中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色；但低血清或是无血清细胞培养基中酚红的含量与普通细胞培养基中的酚红含量不同，不能通过肉眼观察或通过经验来判定pH值，建议使用pH计进行测定。酚红通常对含血清的细胞培养基生产的生物制品质量并不会产生明显影响，也可通过纯化技术去除，但酚红在无血清细胞培养基中可能带来胞内钠/钾失衡，影响细胞生长，这种作用能被血清所中和或减轻。因此，酚红并不是细胞培养基中必需的一种成份，很多国外的疫苗或抗体生产企业在生产过程中都使用无酚红细胞培养基。
碳酸氢钠在细胞培养基中主要是作为缓冲系统，此外还具有调节渗透压的作用。通常产品使用说明中的碳酸氢钠推荐量是一个标准、安全量，是在科学的基础上根据实践经验所得，但是由于不同的细胞系（株）不同，同一株细胞适应环境也可能不同（细胞耐受性不同等），且存在的地域性水质差异等，在实际生产过程中也可稍作改动，但使用者需做相应的检测（理化及细胞生产试验等）。
HEPES是一种非离子缓冲液，在pH 7.2 ～7.4范围内具有较好的缓冲能力，其在高浓度时对一些细胞可能有毒。HEPES缓冲液可与低水平的碳酸钠（0.34 g /L）共用，以抵消因额外加入HEPES引起的渗透压增加。其安全浓度范围是10～25 mmol/L。
丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。
谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4℃下放置1周可分解50%，使用中最好单独配制，置-20℃冰箱中保存，使用前加入细胞培养液中。
（3）细胞培养基使用相关问题
一旦在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时，应该在两到三周内使用完毕。因为一些抗生素和血清中的基本成份在解冻后就开始降解。此外，当在无血清培养基中添加抗生素时，降低至少在有血清培养基中所使用浓度的50%，因为血清中的蛋白会结合和灭活一些抗生素，而在无血清培养条件下，抗生素不被灭活。
通常液体细胞培养基在冷藏条件下可存放6个月到一年，如果细胞培养基偶然被冻，应该使其自然溶解并观察是否有沉淀产生。如果没有沉淀产生，培养基可以正常使用，如果出现沉淀，只能丢弃这些培养基。
（4）细胞培养相关问题
细胞冻存讲究“慢冻”。动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5～10% 二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO) 和90～95%原来细胞生长用的新鲜细胞培养基均匀混合。由于DMSO稀释时会放出大量热能，不可将DMSO直接加入细胞液中，在使用前先行配制完成。用于细胞冻存的大部份添加物和试剂要冷藏，常用液体细胞培养基用于冻存时，最多可以冻融3次，如果次数过多会将使含有的蛋白质发生降解和沉淀，这将会影响培养基的性能。
体外培养的贴壁细胞大多具有生长接触抑制的特性，即当一个细胞被其他细胞包围的时候，它就会停止生长，及时传代后，细胞的生长得以继续。一般采用胰蛋白酶消化的方式进行传代。胰蛋白酶溶液的消化能力与溶液的pH、温度、胰酶浓度及溶液中是否含有Ca2+,Mg2+离子和血清等因素有关，通常情况下胰蛋白酶在pH8.0、温度37℃时作用能力最强，钙、镁离子及血清均能大大降低其消化能力，每次进行传代消化前，先用不含钙、镁离子的缓冲液冲洗细胞培养瓶，去除残留的含血清的培养液，能明显提高消化液的消化能力。多数细胞传代消化使用的消化液为PBS溶液中添加0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA，EDTA主要是用来螯合能够抑制蛋白酶活性的游离的镁离子和钙离子，以保持胰蛋白酶的活性。
通常细胞消化的时间越短越好，但是不同的细胞，其贴壁性有一定的差异，对于易消化的细胞控制其消化程度，对于贴壁性较强的细胞，在消化时可将消化液事先在37℃条件下进行预热，消化时尽量控制在37℃条件下进行，可加快消化的时间及降低对细胞的损伤。值得注意的是，胰蛋白酶在4℃就可能开始降解，如果在室温下放置超过30分钟，就会变得不稳定。
（5）细胞的污染判断及污染的消除
细菌、真菌类污染较易判断，但是支原体污染几乎可影响所有细胞的生长参数、代谢及研究中的任一数据。故进行实验前，必须确认细胞未被支原体污染，实验结果的数据方有意义。除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株，无法以其外观分辨之。通常污染的细胞直接丢弃不再使用。
当重要的培养细胞污染而不能丢弃时，需消除或控制污染。首先，确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母，把污染细胞与其它细胞系隔离开，用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台，检查过滤器等。其次，高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性，因而，做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。
下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。
1）在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细胞传代的浓度。
2）分散细胞悬液到多孔培养板中，或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内，把选择抗生素加入到每一个孔中。例如，两性霉素B推荐下列浓度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0，8.0mg/ml。
3）每天观测细胞毒性指标，如脱落，出现空泡，汇合度下降和变圆。
4）确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度2－3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2－3代。
5）在无抗生素的培养基中培养细胞一代。
6）重复步骤4。
7）在无抗生素的培养基中培养4－6代，确定污染是否以已被消除。
中国微生物查询网（www.biobw.org）