细胞培养之“收到细胞的处理方式”
中国微生物菌种查询网 / 2016-12-02 09:24:28
No.1
1.收到细胞株包裹时，请检查细胞株冷冻管是否有解冻情形，若有请立即通知。细胞株请尽速开始培养，或立即冷冻保存(置于–70C，隔夜后，移到液氮)。
2.冷冻细胞解冻程序:
2.1.依据细胞株数据单指定之基础培养基种类、血清种类和其它指定之成份和比例，制备培养基。绝大多数之细胞均无法立即适应不同之基础培养基或不同之血清种类，若因实验需要，必须有所不同时，务必以缓慢比例渐次改变培养基组成，确定细胞适应后，方进行所需之实验。
2.2.FBS(fetalbovineserum,胚牛血清),CS(calfserum,小牛血清)和HS(horseserum,马血清)，对细胞而言差异极大，请务必依据细胞株资料单指定之血清种类培养之。
2.3.将洁特培养基置于37C水槽中回温，回温后喷以70%酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。取出洁特冷冻管，立即放入37C水槽中快速解冻，水面高度不可接近或高过冷冻管之盖沿，否则易发生污染。轻摇洁特冷冻管使其在1分钟内全部融化后，以70%ethanol擦拭冷冻管外部，移入无菌操作台内。
2.4.依据细胞种类和浓度，于无菌操作台内取10ml培养基加至T25或T75flask中。取出已解冻之细胞悬浮液，缓缓加入T25或T75JET培养瓶内之培养基，混合均匀，放入37C，5%CO2培养箱培养。
2.5.对绝大多数细胞而言，1%以下之冷冻保护剂DMSO，不会对细胞之贴附或活化有不良影响，不需立刻由解冻细胞中去除，待第二天确定细胞生长或贴附良好后再去除即可。惟对极少数因对DMSO敏感或会造成细胞分化之细胞，需立即去除DMSO者，则可将解冻后之细胞悬浮液放入5-10ml洁特培养基中，离心300xg(约1000rpm)，5分钟，小心移去上清液，加入适量新鲜的洁特培养基，将细胞均匀混合后，转移至洁特培养瓶中，再放入37°C，5%CO2培养箱培养。
No.2
收到T25JET培养瓶培养出的细胞时，处理方式为︰
1.于寄送过程中，为避免起泡造成细胞脱落死亡，T25flask均加满洁特培养基。请检查培养瓶的外观，并于显微镜下观察细胞生长状况和有无污染现象，若有任何问题，不要打开盖子，请立即通知细胞实验室。
2.将原封之T25JET培养瓶静置于37°C，5%CO2培养箱中，使细胞回温至37°C，并让运送过程中少数脱落的细胞可再附着生长。隔天后，于无菌操作箱内取出JET培养瓶内之培养基，(取出之培养基可以再使用)，仅留约5-10ml培养基于JET培养瓶内，依一般培养方式再将细胞置入培养箱中，或细胞已长满盘，则将细胞做传代培养。
细胞计数与存活测试
1.原理：
1.1.计算细胞数目可用血球计数盘或是Coultercounter粒子计数器自动计数。
1.2.血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber中细刻9个1mm2大正方形，其中4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为0.1mm。当chamber上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm2x0.1mm=1.0x10-4ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml中之细胞数目。
1.3.存活测试之步骤为dyeexclusion，利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypanblue染料，如果细胞不易吸收trypanblue，则用红色之Erythrosinbluish。
2.材料：
0.4%w/vtrypanblue(GibcoBRL15250-061)
Erythosinbluishstain
取0.1gramErythrosinbluish(SigmaE-9259)及0.05grampreservativemethylparaben(SigmaH-3647)溶于100mlCa++/Mg++freesaline
血球计数盘及盖玻片(Hemocytometerandcoverslip)，计数器(counter)，低倍倒立显微镜
粒子计数器(Coultercounter,CoulterElectronics)
3.步骤：
3.1.取50ml细胞悬浮液与50mltrypanblue(orErythrosinbluish)等体积混合均匀于1.5ml小离心管中。
3.2.取少许混合液(约15ml)自血球计数盘chamber上方凹槽加入，盖上盖玻片，于100倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色(或红色-Erythrosinbluish)。
3.3.计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数(至少乘以2，因与trypanblue等体积混合)，最后乘以104，即为每ml中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。
4大格*细胞总数x2x104/4=细胞数/ml
*每一大格的体积=0.1cmx0.1cmx0.01cm=10-4ml
3.4.若不用血球计数盘，可用Coultercounter作自动计数，惟无法辨别死细胞或活细胞。
3.5.范例：
T75monolayerculture制成10ml细胞悬浮液，取0.1ml溶液与0.1mltrypanblue混合均匀于试管中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内之细胞数目。
活细胞数/方格：55,62,49,59死细胞数/方格：5,3,4,6
细胞总数=243平均细胞数/方格=60.75稀释倍数=2
细胞数/ml：60.75x104x2=1.22x106细胞数/flask：1.22x106x10ml=12.2x106
存活率：225/243﹦92.6%
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