一、实验目的要求
1．明确培养基的配制原理。
2．通过对基础培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤。
3．了解常用培养基的制备方法。
二、实验内容与原理
培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。在自然界中，微生物种类繁多，营养类型多样，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多。但是，不同种类的培养基中，一般应含有水分、碳源、氮源、能源、无机盐、生长因素等。不同微生物对pH要求不一样，霉菌和酵母的培养基的pH一般是偏酸性的，而细菌和放线菌的培养基的pH一般为中性或微碱性的(嗜碱细菌和嗜酸细菌例外)。所以配制培养基时，都要根据不同微生物的要求将培养基的pH调到合适的范围。按成分的不同分天然培养基、合成培养基、半合成培养基。按培养基的物理状态分固体培养基、半固体培养基、液体培养基。按培养基的用途分基础培养基、营养培养基(加富培养基)、鉴别培养基、选择培养基。
牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供作微生物生长繁殖之用。基础培养基含有牛肉膏、蛋白胨和NaCl。其中牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，而NaCl提供无机盐。在配制固体培养基时还要加入一定量琼脂作凝固剂，琼脂在常用浓度下96℃时溶化，实际应用时，一般在沸水浴中或下面垫以石棉网煮沸溶化，以免琼脂烧焦。琼脂在40℃时凝固，通常不被微生物分解利用。固体培养基中琼脂的含量根据琼脂的质量和气温的不同而有所不同。
由于这种培养基多用于培养细菌，因此要用稀酸或稀碱将其pH调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖。
三、主要仪器与设备
1．溶液或试剂 牛肉膏，蛋白胨，NaCl，琼脂，1 mol/L NaOH，1 mol/L HCl。
2．仪器或其他用具 试管，培养皿，三角瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装器，天平，牛角匙，高压蒸气灭菌锅，电烘箱，pH试纸(pH 5.5～9.0)，棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。
四、操作方法、实验步骤
（一）掌握牛肉膏蛋白胨培养基的配制方法
100牛肉膏蛋白胨培养基的配方如下：
（1）液体
牛肉膏 0.3g
蛋白胨 1g
NaCl 0.5 g
蒸馏水 1 00 ml
pH 7.4～7.6
（2）半固体 100mL液体培养基调完pH以后加0.8g琼脂
（3）固体 100mL液体培养基调完pH以后加2g琼脂
1．称量
按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放人烧杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。也可放在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。
蛋白胨很易吸湿，在称取时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净，擦干，再称取另—药品。瓶盖也不要盖错。
2．溶化
在上述烧杯中先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。将药品完全溶解后，补充水到所需的总体积，如果配制固体培养基时，将称好的琼脂放入已溶的药品中，再加热溶化，最后补足所损失的水分。在制备用三角瓶盛固体培养基时，一般也可先将一定量的液体培养基分装于三角瓶中，然后按1.5％～2.0％的量将琼脂直接分别加入各三角瓶中，不必加热溶化，图Ⅳ-1 磁力搅拌加热溶解图
而是灭菌和加热溶化同步进行，节省时间。
在琼脂溶化过程中，应控制火力，以免培养基因沸腾而溢出容器。同时，需不断搅拌，以防琼脂糊底烧焦。配制培养基时，不可用铜或铁锅加热溶化，以免离子进入培养基中，影响细菌生长。
3．调pH
在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1 mol／L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH，直至pH达7.6。反之，用1mol/L HCl进行调节。
对于有些要求pH较精确的微生物，其pH的调节可用酸度计进行(使用方法、可参考有关说明书)。
pH不要调过头，以避免回调而影响培养基内各离子的浓度。配制pH低的琼脂培养基时，若预先调好pH并在高压蒸气下灭菌，则琼脂因水解不能凝固。因此，应将培养基的成分和琼脂分开灭菌后再混合，或在中性PH条件下灭菌，再调整pH。
4．过滤
趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利某些实验结果的观察。一般无特殊要求的情况下，这一步可以省去(本实验勿需过滤)。
5．分装
按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。分装过程中，注意不要使培养基沾在管(瓶)口上，以免沾污棉塞而引起污染。
(1) 液体分装 分装高度以试管高度的1/4左右为宜。分装三角瓶的量则根据需要而定，一般以不超过三角瓶容积的一半为宜，如果是用于振荡培养用，则根据通气量的要求酌情减少；有的液体培养基在灭菌后，需要补加一定量的其他无菌成分，如抗生素等，则装量一定要准确。
(2) 固体分装 分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。
6．加塞
培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞(或泡沫塑料塞及试管帽等)，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能(棉塞制作方法附本实验后面)。
7．包扎
加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。
(有条件的实验室，可用市售的铝箔代替牛皮纸，省去用绳扎，而且效果好。)
8．灭菌
将上述培养基以0.103 MPa，121℃，20 min高压蒸气灭菌。
9．搁置斜面
将灭菌的试管培养基冷至50℃左右(以防斜面上冷凝水太多)，将试管口端搁在玻棒或其他合适高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。
10. 制备固体平板培养基
用烘箱将表面皿灭菌后备用。在超净工作台上趁热将灭菌后的培养基倾倒到表面皿中，放凉，备用。
11．无菌检查
将灭菌培养基放人37℃的温室中培养24～48h，以检查灭菌是否彻底。
（二）了解蛋白胨水培养基的配制方法
蛋白胨 20 g
NaCl 5 g
蒸馏水 1 000 ml
pH 7.6
（三）了解乳糖发酵培养基的配制方法
蛋白胨水培养基 1 000 ml
1.6％溴甲酚紫乙醇溶液 1～2 ml
pH 7.6
另配20％乳糖溶液：乳糖5g溶于25mL蒸馏水中。
制法：调完pH7.6后加入乳糖溶液10mL，分装，在每只试管内放一倒置的小玻璃管（Durham tube），使充满培养液。灭菌。
（四）了解葡萄糖发酵培养基的配制方法
蛋白胨水培养基 1 000 ml
1.6％溴甲酚紫乙醇溶液 1～2 ml
pH 7.6
另配20％葡萄糖溶液：葡萄糖5g溶于25mL蒸馏水中。
制法：调完pH7.6后加入乳糖溶液10mL，分装，在每只试管内放一倒置的小玻璃管（Durham tube），使充满培养液。灭菌。
（五）了解葡萄糖蛋白胨水培养基的配制方法
蛋白胨 5 g
葡萄糖 5 g
K2HPO4 2 g
蒸馏水 1 000 ml
将上述各成分溶于1 000 ml水中，调pH7.0～7.2，过滤。分装试管，每管10 ml，112℃灭菌30min。
（六）了解柠檬酸盐培养基的配制方法
NH4H2PO4 1.5g
K2HPO4 l .5g
NaCl 7.5 g
MgSO4 0.3 g
柠檬酸钠 3g
蒸馏水 1 000 ml
1％溴香草酚蓝乙醇溶液 10 ml
将上述各成分加热溶解后，调pH6.8，加入琼脂30g，然后加入指示剂，摇匀。制成后为黄绿色，分装试管，121℃灭菌20 min后制成斜面。注意配制时控制好pH，不要过碱，以黄绿色为准。
（七）了解醋酸铅培养基的配制方法
pH7.4的牛肉膏蛋白胨琼脂 100 ml
硫代硫酸钠 0.25 g
10％醋酸铅水溶液 1 ml
将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基100 ml加热溶解，待冷至60℃时加入硫代硫酸钠0.25 g，调至pH7.2，分装于三角瓶中，115℃灭菌15 min。取出后待冷至55～60℃，加入10％醋酸铅水溶液(无菌的)1ml，混匀后倒入灭菌试管或平板中。
（八）了解血琼脂培养基的配制方法
pH7.6的牛肉膏蛋白胨琼脂 100 ml
脱纤维羊血(或兔血) 10 ml
将牛肉膏蛋白胨琼脂加热溶化，待冷至50℃时，加入无菌脱纤维兔血摇匀后倒平板或制成斜面。37℃过夜检查无菌生长即可使用。
注：无脱纤维兔血(或羊血)的制备
用配备18号针头的注射器以无菌操作抽取全血，并立即注入装有无菌玻璃珠(约3 mm)的无菌三角瓶中，然后摇动三角瓶10 min左右，形成的纤维蛋白块会沉淀在玻璃珠上，把含血细胞和血清的上清液倾入无菌容器即得到脱纤维兔血，置冰箱备用。整个过程必须严格无菌操作；制备脱纤维血液时，应摇动足够时间以防凝固。
将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基溶化，待冷至45℃～50℃时，以无菌操作按10％加入无菌脱纤维兔血(或羊血)于培养基中，立即摇荡，以便血液和培养基充分混匀。45℃～50℃加入血液是为了保存其中某些不耐热的营养物质和保存血细胞的完整，以便于观察细菌的溶血作用。同时，在这种温度时琼脂不会凝固。迅速以无菌操作倒入无菌平皿中，使成血液琼脂平板。注意不要产生气泡。置37℃过夜，如无菌生长即可使用。
中国微生物查询网（www.biobw.org）